甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物及其制备方法和应用

：本发明属于生物医药，涉及甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物的结构及其获得方法与应用，具体地说，本发明涉及甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物及其衍生物、类似物、活性片段的结构及其制备方法，以及其在微生物及其相关分子模式检测、诱导昆虫酚氧化酶原激活系统、制备甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物及其衍生物、类似物、活性片段抗体等方面的应用。

背景技术

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背景技术：

1、先天性免疫系统是昆虫抵御外源病原体入侵最有效且唯一的防御机制，是生态系统中的重要一环。丝氨酸蛋白酶级联途径中蛋白酶在识别异常组织或微生物后通过特定的分子相互作用和蛋白水解被依次激活，形成初始信号的快速、局部的放大反应，从而发挥免疫效应。丝氨酸蛋白酶羧基末端的催化结构域的活性位点往往由组氨酸、天冬氨酸和丝氨酸残基组成，即“催化三联体”。当该催化三联体结构发生氨基酸突变或直接缺失，这类丝氨酸蛋白酶便失去了催化活性，称为丝氨酸蛋白酶同系物(serine protease homolog，sph)。

2、丝氨酸蛋白酶及其同系物通过参与酚氧化酶原激活系统和toll通路的级联反应，在节肢动物的先天免疫中发挥作用。在烟草天蛾中，宿主prrs识别入侵病原体后，丝氨酸蛋白酶hp14、hp21、prohp1、hp6、hp8、pap1-3和非催化丝氨酸蛋白酶同系物(sph1和sph2)可以构成细胞外sp-sph系统介导黑色素形成和其他免疫反应。在黄粉虫中，丝氨酸蛋白酶级联放大系统可同时激活toll途径及ppo，该系统包括可被顺序激活的三种不同丝氨酸蛋白酶。只有特定的sph存在才能在黄粉虫中适当地激活酚氧化酶原，触发黑色素合成。黄粉虫sph1这种高特异性的非催化调节蛋白对于调节黑色素的产生不可缺少。2010年zhao等(zhao p,wang g,dong z,et al.genome-wide identification and expression analysis ofserine proteases and homologs in the silkworm bombyx mori[j].bmc genomics,2010,11(1):405.)将家蚕核型多角体病毒、白僵菌、孟买芽孢杆菌和e.coli的混合菌液以喂食方式侵染家蚕幼虫，诱导后18个sp或sph基因表达显著上调，说明sp和sph基因可能参与了家蚕对病原微生物的抵抗。2011年sakamoto等人(sakamoto m,ohta m,suzuki a,etal.localization of the serine protease homolog bmsph-1in nodules of e.coli-injected bombyx mori larvae and functional analysis of its role in nodulemelanization[j].developmental and comparative immunology,2011,35(5):611-619.)的研究表明家蚕sph1和sph2可能与脂多糖结合蛋白bmlbp一起结合到大肠杆菌表面从血淋巴进入结节，是结节黑化的重要调节因子。2018年lee等人(lee k s,kim b y,choo y m,etal.dual role of the serine protease homolog bmsph-1in the development andimmunity of the silkworm bombyx mori[j].developmental and comparativeimmunology,2018,85:170-176.)进一步研究发现家蚕sph-1可以与家蚕免疫球蛋白(b.mori immulectin，bmiml)、bmppae和bmppo形成ppo激活复合物，在感染期间定位于血细胞，促进免疫反应中结节的形成。2021年yang等(yang h,ji t,xiong h,et al.a trypsin-like serine protease domain of masquerade gene in crayfish procambarusclarkii could activate prophenoloxidase and inhibit bacterial growth[j].developmental and comparative immunology,2021,117:103980.)人证实克氏原螯虾中的丝氨酸蛋白酶同系物mas可通过与细菌结合激活酚氧化酶原激活系统，从而参与甲壳类动物的先天性免疫防御。

3、综上所述，丝氨酸蛋白酶同系物在昆虫抵御病原微生物的入侵和感染相关反应中起着至关重要的作用。目前尚未见对鳞翅目(lepidoptera)的天(大)蚕蛾科昆虫丝氨酸蛋白酶同系物，尤其是甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物的结构、制备及生物学功能的研究。

技术实现思路

0、
技术实现要素：

1、本发明是针对鳞翅目的天(大)蚕蛾科昆虫体内的甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物，研究天然甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物的制备方法、一级结构(基因和蛋白质)、生物学功能以及其应用，利用基因工程技术获得重组甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物及其衍生物或类似物或活性片段以及其生物学功能和应用。此外，利用天然、重组甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物及其衍生物或类似物或活性片段作为抗原，刺激机体产生抗体，同时研究了该抗体的应用。

2、在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞，常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。

3、本发明所解决的技术问题是提供一种从鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫中获取甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物(mannan-binding serine protease homologue,msph)的制备方法、结构、生物学功能及其应用。首先利用蛋白提取、分离、纯化技术，从鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫中分离、纯化获得天然甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物。其次，利用蛋白质化学技术以及分子生物学技术，解析甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物的一级结构(基因和蛋白质)并获得其基因。再次，利用基因工程技术，实现甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物基因在宿主细胞的表达，结合蛋白提取、分离、纯化技术获得重组甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物。同时，利用基因重组技术，获得了甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物的衍生物或类似物或部分片段。天然、重组甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物以及其衍生物或类似物或部分片段，能够结合除脂多糖以外包括β-1,3-葡聚糖、肽聚糖、脂磷壁酸、甘露聚糖等在内的多种微生物相关分子模式，并能特异性激活由脂多糖、β-1,3-葡聚糖、肽聚糖、脂磷壁酸、甘露聚糖等多种微生物相关分子模式以及细菌、真菌等微生物所诱导的酚氧化酶原激活系统，对toll信号途径介导的抗菌肽产生具有抑制作用。

4、本发明提供如下技术方案：

5、本发明提供一种甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物，其氨基酸序列如seq idno：1所示。

6、基于上述技术方案，进一步地，所述的甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物来源于鳞翅目(lepidoptera)天(大)蚕蛾科(saturniidae)昆虫，选自柞蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度柞蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕中的一种。

7、本发明另一方面提供编码所述的甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物的基因。

8、基于上述技术方案，进一步地，所述的甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物的基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。

9、本发明另一方面提供所述的甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物的衍生物或类似物或活性片段，包含氨基酸序列如seq id no：1所示全部序列或部分序列，且具有甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物的生物学活性。

10、基于上述技术方案，进一步地，所述的甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物的衍生物或类似物或活性片段选自met-msph、met-his6标签-msph、met-msph-his6标签、met-his6标签-凝血酶酶切位点-msph、met-gst标签-凝血酶酶切位点-msph、met-msph-凝血酶酶切位点-gst标签、met-msph-flag标签、met-flag标签-msph、met-his6标签-sumo标签-凝血酶酶切位点-msph、met-his6标签-sumo标签-凝血酶酶切位点-msph-his6标签序列。

11、本发明另一方面提供所述的甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物的制备方法，利用鳞翅目天蚕蛾科昆虫的血淋巴、血液、血细胞裂解物、淋巴液、匀浆液中的一种或两种以上的组合作为原料液，通过离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤、盐析或超滤方法中一种或两种以上方法的组合获得电泳纯乃至hplc纯度的甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物；

12、或者将编码所述的甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物的基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物。

13、基于上述技术方案，进一步地，所述的离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤、盐析或超滤方法中：

14、(1)操作温度在0℃-45℃，优选0℃-10℃；

15、(2)溶液的酸碱度在ph2-ph12，优选ph4-ph10；

16、(3)调节溶液酸碱度的试剂为是常规、通用的酸、碱、酸溶液或碱溶液，酸或酸溶液优选hcl、hac、磷酸、柠檬酸、硫酸、硼酸或其混合溶液，碱或碱溶液优选naoh、koh、tris、柠檬酸钠或钾盐、磷酸钠或钾盐、硼砂或其混合溶液；

17、(4)缓冲液是常规、通用缓冲离子对缓冲液，优选柠檬酸根缓冲离子对、hcl-tris缓冲离子对、柠檬酸根-磷酸根缓冲离子对、磷酸根缓冲离子对、醋酸根缓冲离子对、硼酸根缓冲离子对、硼酸-tris缓冲离子对或上述各缓冲离子的组合；

18、(5)溶液或缓冲液的离子强度在0.001mol/l-0.5mol/l，优选0.01mol/l-0.1mol/l。

19、本发明另一方面提供所述的甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物的衍生物或类似物或活性片段的制备方法，将编码所述的甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物衍生物或类似物或活性片段的基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，分离纯化后获得重组表达的所述的甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物的衍生物或类似物或活性片段。

20、基于上述技术方案，进一步地，表达体系包括原核生物系统和昆虫细胞系统，原核生物系统的宿主细胞为大肠杆菌细胞或枯草杆菌细胞；昆虫细胞系统的宿主细胞为昆虫细胞；表达形式为细胞内表达或分泌形式表达。

21、本发明另一方面提供所述的甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物或其衍生物或类似物或活性片段的抗体，以所述的天然甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物或所述的甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶的衍生物或类似物或活性片段作为抗原，刺激小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的免疫系统产生。

22、本发明另一方面提供所述的甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物或所述的甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物衍生物或类似物或活性片段或所述的抗体在影响酚氧化酶原激活系统、抗菌肽合成、微生物及其相关分子模式检测中的应用。

23、基于上述技术方案，进一步地，所述的相关分子模式包括β-1,3-葡聚糖、肽聚糖、脂磷壁酸、甘露聚糖。

24、本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：

25、本发明所述的天然、重组msph及其部分片段或衍生物或类似物获得方法常规、简单、产量高；本发明的天然、重组甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物以及其衍生物或类似物或部分片段以及其抗体可广泛应用于针对微生物的预防、检测、治疗药物等领域。