一种小麦抗条锈病基因YrNP63的功能KASP分子标记及其应用

本发明属于小麦基因检测，具体涉及一种小麦抗条锈病基因yrnp63的功能kasp分子标记及其应用。

背景技术：

1、小麦条锈病是最重要的小麦病害之一，在全球几乎所有小麦生产区均有发生，严重危害小麦安全生产，每年都造成数百万吨的产量损失。由于小麦条锈病属于气传性病害，具有流行范围广、传播速度快等特点，通过喷施杀菌剂防控困难，不仅耗财耗力，而且还会造成环境污染。与之相比，通过培育和种植抗病品种进行防控，则具有便捷、经济、有效、且环境友好等优点。

2、尽管目前已有84个抗条锈病基因和超过380个qtl被定位和报道，但是由于这些基因/qtl的研究还不够深入，多是处于初定位阶段，存在定位区间大，连锁分子标记容易发生重组，遗传效应不清晰，连锁累赘等问题，在生产上成功应用的并不多。此外，条锈菌的快速变异以及新生理小种的出现，常常导致抗病基因或者抗病品种丧失抗性，特别是自进入21世纪以来，伴随着cyr32、cyr33和cyr34等强致病小种的出现，使我国生产上使用最广泛的抗病基因yr9、yr26和yrzh84等相继丧失抗病性，因此，急需在我国小麦中引入新的抗病基因。

3、而yrnp63基因，是通过图位克隆的方法从国际玉米小麦改良中心(cimmyt)的持久抗病春小麦品种napo63中发现并克隆的一个全生育期抗条病基因，目前对中国小麦条锈菌流行小种均保持很好的抗性，位于中国春参考基因组1.0版本的2bs染色体157688966..157696282(-strand)bp位置，该基因将在未来的几年甚至几十年时间内为我国小麦抗条锈病品种育种做出重要贡献，然而，目前尚无针对该基因的鉴定的功能型分子标记的研究，因此，开发一种小麦抗条锈病基因yrnp63的功能kasp分子标记，促进yrnp63基因在分子育种中的应用，对于加快小麦抗病分子辅助育种的进程具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供了一种小麦抗条锈病基因yrnp63的功能kasp分子标记及其应用，其利用共分离的特异性snp位点设计引物，对抗条锈菌基因yrnp63进行鉴定，解决了连锁分子标记技术容易发生重组，遗传效应不清晰，连锁累赘等问题，促进yrnp63基因的在分子育种中的应用。

2、为实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下：

3、一种小麦抗条锈病基因yrnp63的功能kasp分子标记，所述功能kasp分子标记为kasp2683，所述功能kasp分子标记是根据特异性snp位点g2683a设计的kasp2683的引物扩增dna模板所获得的核苷酸序列；所述snp位点g2683a位于yrnp63编码基因cds序列的第2683位，snp位点g2683a的多态性分别为a/g。

4、作为进一步的技术方案，所述snp位点g2683a前后各90nt的dna单链序列如seqidno:1所示；

5、作为进一步的技术方案，所述snp位点g2683a位于seq id no:1所示序列中的第91处的碱基，碱基突变是a/g。

6、一种小麦抗条锈病基因yrnp63的功能kasp分子标记的引物，所述功能kasp分子标记为kasp2683，所述功能kasp分子标记的引物包括感病位点正向引物kasp2683-fam、抗病位点正向引物kasp2683-hex和共用反向引物kasp2683-common；

7、感病位点正向引物kasp2683-fam的核苷酸序列如seq id no:2所示；

8、抗病位点正向引物kasp2683-hex的核苷酸序列如seq id no:3所示；

9、共用反向引物kasp2683-common的核苷酸序列如seq id no:4所示。

10、一种所述的小麦抗条锈病基因yrnp63的功能kasp分子标记在鉴定小麦材料中是否含有抗条锈病基因yrnp63、小麦抗条锈病基因yrnp63的种质资源筛查或小麦分子辅助选择育种中的应用。

11、一种所述的小麦抗条锈病基因yrnp63的功能kasp分子标记的引物在鉴定小麦材料中是否含有抗条锈病基因yrnp63、小麦抗条锈病基因yrnp63的种质资源筛查或小麦分子辅助选择育种中的应用。

12、一种鉴定小麦材料中是否含有抗条锈病基因yrnp63的方法，包括如下步骤：

13、步骤1、提取待测小麦材料的基因组dna；

14、步骤2、以待测小麦材料的基因组dna为模板，利用所述功能kasp分子标记kasp2683的引物对待测样品的基因组dna进行pcr扩增，获得扩增产物；

15、所述功能kasp分子标记为kasp2683的引物包括感病位点正向引物kasp2683-fam、抗病位点正向引物kasp2683-hex和共用反向引物kasp2683-common；

16、感病位点正向引物kasp2683-fam的核苷酸序列如seq id no:2所示；

17、抗病位点正向引物kasp2683-hex的核苷酸序列如seq id no:3所示；

18、共用反向引物kasp2683-common的核苷酸序列如seq id no:4所示。

19、步骤3、将扩增产物移至酶标仪中读取荧光数据，然后将所述荧光数据导入klustercaller软件进行分析得到基因型数据，获得基因型。

20、其中，带有hex荧光的纯合等位基因基因型为“y:y”，带有fam荧光的纯合等位基因基因型为“x:x”，杂合体基因型为“x:y”或者“y:x”，缺失值基因型为“？”。基因型为“y:y”或“x:y”或者“y:x”，则待测小麦材料含有抗条锈病基因yrnp63，基因型为“x:x”，则待测小麦材料不含有抗条锈病基因yrnp63。

21、作为进一步的技术方案，所述pcr扩增的反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，65℃退火60s，10个循环，每循环退火温度降低0.6℃；94℃变性20s，55℃退火60s，32个循环。

22、作为进一步的技术方案，所述pcr扩增的反应体系为：dna0.2μg，2×kaspv4.0mastermix 2μl，引物混合物0.044μl，ddh2o 1.956ml。

23、作为进一步的技术方案，引物混合液中，感病位点正向引物kasp2683-fam的浓度为12mm/ul，抗病位点正向引物kasp2683-hex的浓度为12mm/ul，共用反向引物kasp2683-common的浓度为30mm/ul。

24、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

25、本发明通过研究找到了与小麦抗条锈病基因yrnp63共分离的特异性snp位点g2683a，并基于特异性snp位点g2683a开发了yrnp63的功能型kasp分子标记kasp2683，其属于功能标记，相比较于传统的连锁标记技术而言，功能标记与目的基因共分离，不存在重组现象，在追踪基因yrnp63时更为精准，有利于小麦分子标记辅助育种体系的建立。

26、本发明所述的功能型kasp分子标记kasp2683可以简便、快速、高通量地应用于小麦分子辅助育种和yrnp63基因的种质资源筛查中。