褐黄血蜱铁蛋白、基因及制备方法和应用

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种褐黄血蜱铁蛋白、基因及制备方法和应用。

背景技术：

1、蜱 (tick) 是一类最常见的以吸食脊椎动物血液为生的体外寄生虫。蜱总科包括硬蜱科( ixodidae)、软蜱科( argasidae)和单属单种的纳蜱科( nuttalliellidae)，其中种类最多、危害最大的为硬蜱科。目前，全世界已知蜱类共有18属899种，中国境内蜱类已报道有2科10属共119种。

2、蜱的叮咬和大量吸血造成人或动物的皮肤损伤、局部痛痒、贫血和消瘦等直接损害，同时也传播多种对民众健康和畜牧业生产构成严重威胁的多种疾病，如蜱传脑炎( tick-borne encephalitis)、莱姆病( lyme disease)和梨形虫病( piroplasmosis)等。据统计，全球每年有数亿头动物受到蜱和蜱传疾病的影响，用于预防、治疗蜱和蜱传疾病的开支巨大。

3、褐黄血蜱（haemaphysalis flava）是硬蜱科血蜱属的成员。褐黄血蜱可以寄生于山羊、狗、黄牛、马、绵羊等多种家养动物，也可寄生于刺猬、野兔、大熊猫、野猪和鸟类等多种野生动物，还有叮咬人的报道。褐黄血蜱可以携带多种病原体，其中包括新布尼亚病毒、蜱传脑炎病毒、立克次体、螺旋体、无形体、巴尔通体、土拉杆菌和盘丝虫。因此，褐黄血蜱对畜牧业发展和人类健康的潜在威胁不容忽视。

4、目前，防控蜱的主要措施是采用有机磷等化学药物。然而，化学药物灭蜱会导致药物残留和环境污染的安全问题，长期使用还会导致耐药蜱株出现进而降低药物对蜱的杀灭作用。因而，化学灭蜱存在的种种问题迫使研究人员不断探索更加经济和安全的控蜱新措施。澳大利亚研究人员在控蜱疫苗方面取得了突破性进展，即分离、重组微小扇头蜱( rhipicephalus microplus)中肠糖蛋白bm86抗原并成功商业化应用于该蜱的防控，使人们意识到筛选功能基因和蛋白制备抗蜱疫苗以防控蜱类的危害是经济安全和确实可行的措施。然而，已经商业化的抗微小扇头蜱疫苗具有蜱种局限性，亟需寻找新的广谱、高效的控蜱抗原分子。

5、蜱完全依赖宿主血液获取营养并进行繁殖的节肢动物。宿主血液中含有大量的铁，铁元素是蜱生殖和胚胎发育必需的营养物质，在多种生理过程起到重要作用，如参与细胞呼吸、能量代谢和dna合成等。但铁也参与自由基的形成，形成氧化应激，进而可能导致细胞损伤和死亡。因此，蜱需应对来自宿主血液中过量铁的毒性挑战。

6、硬蜱同时具有胞内铁蛋白(intracellular ferritin，fer1)和分泌型铁蛋白(secretory ferritin，fer2)。fer1与脊椎动物铁蛋白h亚基相似，每个单体分子量为20-21kda，具有保守的亚铁氧化酶中心基序，形成一个分子量为510 kda的24聚体。硬蜱的fer2也有类似于脊椎动物的铁蛋白h亚基，每个单体的分子量为21 kda。与基因fer1相比，fer2序列缺少ire，与静水椎实螺( lymnaea stagnalis)卵黄、曼氏血吸虫( schistosoma mansoni)和盘鲍( haliotis discus discus)铁蛋白mrna类似。硬蜱fer2与昆虫分泌fer一样在硬蜱体内具有运输铁的功能。

7、基因干扰试验表明，fers对长角血蜱（haemaphysalis longicornis）和篦子硬蜱的成功吸血和繁殖具有重要意义。fers基因干扰后，雌蜱吸血失败，繁殖力下降。基因干扰蜱脱离宿主后，不产卵且死亡率也很高。部分饱血蜱的中肠形态学分析显示，基因敲除蜱的消化细胞出现异常，比如微绒毛和细胞膜被破坏，细胞质空泡化以及血红素产生降低。血红素减少表明消化活动降低，也表明fers在功能正常的消化细胞中起重要作用。敲除fer基因似乎对影响蜱繁殖能力的vg基因的表达也有间接影响。沉默长角血蜱的fer1基因会导致hlvg-1的沉默以及hlvg-3的表达降低；而沉默fer2可导致hlvg-1和hlvg-3表达的降低。但是，目前并没有出现褐黄血蜱重组铁蛋白的相关报道。因而，加大对褐黄血蜱重组铁蛋白的研究对畜牧业发展和人类健康具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种褐黄血蜱铁蛋白及其基因，该褐黄血蜱铁蛋白可用于制备硬蜱疫苗。

2、为实现上述目的，本发明采取下述技术方案：

3、本发明提供了一种褐黄血蜱铁蛋白，包括氨基酸序列如seq id no.8所示的hf-fer1和氨基酸序列如seq id no.16所示的hf-fer2。

4、本发明还提供了一种褐黄血蜱铁蛋白基因，包括编码如seq id no.8所示氨基酸序列的核苷酸序列和编码如seq id no.16所示氨基酸序列的核苷酸序列。

5、更优选的，所述编码如seq id no.8所示氨基酸序列的核苷酸序列seq id no.7所示，所述编码如seq id no.16所示氨基酸序列的核苷酸序列如seq id no.15所示。

6、本发明的第三个目的在于提供了一种重组表达载体，包括pet- hf-fer1和pet-hf-fer2，所述pet- hf-fer1包含权利要求3中seq id no.7所示的核苷酸序列，所述pet-hf-fer2包含权利要求3中seq id no.15所示的核苷酸序列。

7、本发明还提供了一种褐黄血蜱铁蛋白的制备方法，包括以下步骤：

8、s1，从褐黄血蜱中提取总rna；

9、s2，以褐黄血蜱总rna为模板进行反转录，分别得到hf-fer1的反转录cdna和hf-fer2的反转录cdna；

10、s3，设计引物，以s2得到的反转录cdna为模板进行pcr扩增，得到hf-fer1基因和hf-fer2基因；

11、s4，设计引物，分别以hf-fer1基因和hf-fer2基因为模板，以pgemtm-t easy为载体进行克隆，构建质粒teasy-hf-fer1和teasy-hf-fer2；

12、s5，将teasy-hf-fer1使用ecor i和sal i双酶切，酶切产物纯化后与载体pet-32a连接，转化到dh5 α感受态细菌，构建重组表达质粒pet- hf-fer1；将测序正确的teasy-hf-fer2使用ecori和not i双酶切，酶切产物纯化后与载体pet-32a连接，转化到dh5 α感受态细菌，构建重组表达质粒pet- hf-fer2；

13、s6，将重组表达质粒pet- hf-fer1和pet-hf-fer2分别进行诱导表达；

14、s7，对诱导表达的褐黄血蜱铁蛋白进行纯化处理得到hf-fer1重组蛋白和hf-fer2重组蛋白。

15、在本发明中，所述s2包括以下具体步骤：

16、s21，以褐黄血蜱总rna为模板进行反转录，分别合成5'-race和3'-race所需第一链cdna模板；

17、s22，以5'-race cdna和3'-race cdna为模板，用如seq id no.1所示的序列、如seq id no.2所示的序列和upm为引物，进行第一轮pcr扩增反应；

18、将第一轮pcr扩增的产物作为第二轮pcr扩增模板，用如seq id no.3所示的序列、如seq id no.4所示的序列和ups为引物进行第二轮pcr扩增，分别得到hf-fer1的5'-和3'-末端核苷酸序；

19、s23，以5'-race cdna和3'-race cdna为模板，用如seq id no.9所示的序列、如seq id no.10所示的序列和upm为引物，进行第一轮pcr扩增；

20、将第一轮pcr扩增产物作为第二轮pcr扩增模板，用如seq id no.11所示的序列、如seq id no.12所示的序列和ups为引物进行第二轮pcr扩增，分别得到hf-fer1的5'-和3'-末端核苷酸序；

21、s24，将测序获得5'-和3'-末端核苷酸序列与unigenes进行拼接，得到hf-fer1基因的全长cdna和hf-fer2基因的全长cdna。

22、优选的，所述s4中，构建质粒teasy-hf-fer1的引物包括如seq id no.17所示的序列和如seq id no.18所示的序列；构建质粒teasy-hf-fer2的引物包括如seq id no.19所示的序列和如seq id no.20所示的序列。

23、本发明还提供了褐黄血蜱铁蛋白在制备针对蜱类叮咬的疫苗中的应用。

24、与现有技术相比，本发明采用pet32(a)表达载体通过大肠杆菌bl21（de3）表达hf-fer1和hf-fer2蛋白，利用限制性内切酶分别将带有终止密码子的hf-fer1-orf和hf-fer2-orf插入pet32(a)表达载体构建仅表达n端的his标签的重组质粒，转化大肠杆菌bl21（de3），经诱导剂iptg诱导，sds-page检测显示，在38kda位置左右出现目的条带，与预计大小一致。

25、本发明利用融合蛋白rhf-fer1和rhf-fer2在n端有his标签、在c端无his标签的特点，使用人工表达的、带有his标签的商品化的renterokinase对初步纯化和复性的rhf-fer1和rhf-fer2进行37℃酶切，并利用ni-nta his•bind resin纯化柱对酶切产物进行纯化以去除载体蛋白，最终在穿出液中获得到无his标签的重组蛋白，尽可能地降低载体蛋白对重组蛋白功能的影响。另外，本发明中rhf-fer1和rhf-fer2的天然电泳，首次表明重组蛋白rhf-fer1和rhf-fer2均能各自聚合形成24个亚基组成的四级结构，克服了现有重组蛋白rhl-fer2不能形成多数铁蛋白所具有的典型24聚体结构的技术缺陷。

26、铁蛋白是蜱进行铁代谢的几种蛋白之一，也是被认为是抗蜱疫苗的重要靶标蛋白。本发明经过复性、去载体蛋白得到的重组蛋白rhf-fer1和rhf-fer2都具有与rhl-fer2和阳性对照马铁蛋白相同的铁吸收和储存能力。铁蛋白有很高的铁结合能力，并且在有氧的条件下很容易与溶液中的二价铁离子产生相互作用，为褐黄血蜱hf-fer1和hf-fer2的疫苗开发研究奠定基础。