高效、精准稻米总叶酸检测试剂盒及其制备和使用方法与流程

本发明属于稻米品质检测，具体涉及一种高效、精准稻米总叶酸检测试剂盒及其制备和使用方法。

背景技术：

1、叶酸，一种水溶性b族维生素，分子式为c19h19n7o6，因绿叶中含量十分丰富而得名，也称为喋酰谷氨酸、vb9、维生素m，是四氢叶酸及其系列衍生物的总称。

2、叶酸在生物体内的代谢过程较为复杂，它是介导一碳代谢的重要辅助因子，也是维持植物细胞正常功能的基础物质之一。叶酸作为机体细胞生长和繁殖必不可少的维生素之一，在人类营养与健康方面起着重要的关键作用，严重缺乏叶酸时会导致神经管缺陷类疾病等，而人类自身不能合成叶酸，只能通过外源食物摄取。

3、作物营养强化在改善叶酸等微量营养缺乏方面发挥着重要作用，可以有效解决“隐性饥饿”问题。稻米是主要消费的粮食作物之一，其叶酸含量约8μg/100g，无法满足稻米消费人群每天400μg的推荐叶酸摄入量，这可以通过高叶酸稻米产品的研发来实现。因此，高效、精准的稻米叶酸检测成为高叶酸水稻种质研究的关键。

4、近年来，叶酸含量测定已出现多种不同的检测技术。目前，常用的叶酸测定方法有：微生物法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、荧光检测法和酶联免疫法等，相对应的检测试剂盒也陆续被研发，但专门针对稻米叶酸含量测定的高效、精准检测试剂盒在市面上还未见销售。最早发展的微生物法是检测总叶酸的经典技术，尤其适用于植物材料的叶酸含量测定，是国际测定食物成分中叶酸含量的常用方法；但因在测试试剂准备环节繁琐且无法准确掌握所需用量而造成多次制备 或浪费和保存难，因需要环境条件严、样品量大、耗材规格大、试剂用量大且无法统一连续操作而造成实验误差、耗时费力、准确性低，进而无法直接应用于检测数量多、操作时间短且结果准确性要求高的稻米叶酸含量检测。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种高效、精准稻米总叶酸检测试剂盒及其制备和使用方法，对高叶酸水稻种质创制和高叶酸稻米产品开发提供技术支撑，具有广泛的应用前景和市场价值。

2、为实现上述目的，本发明采取如下技术方案是：

3、一种高效、精准稻米总叶酸检测试剂盒的制备方法，

4、1）测定指示菌制备，利用鼠李糖乳杆菌冻干粉经复活、单克隆、扩繁、适应性培养、清洗和富集过程制备，体积为120μl/管，-80℃保存；按照以下步骤在无菌条件下进行：

5、①鼠李糖乳杆菌活化培养：蘸取少量鼠李糖乳杆菌冻干粉，原始菌株，atcc7469，溶于1.0ml乳酸杆菌肉汤液体培养基，37℃静置、暗培养直至产生浑浊；蘸取少量菌液至乳酸杆菌肉汤固体培养基进行划线接种，37℃静置、暗培养直至出现单克隆菌斑；挑取单克隆菌斑至乳酸杆菌肉汤液体培养基中，37℃静置、暗培养至菌液od600为0.6～0.8之间；

6、②鼠李糖乳杆菌的叶酸环境适应性培养：将步骤①中活化培养的菌液按照菌液:培养基=1:100体积比加入到体积比为1:1的叶酸测定培养基与0.15ng/ml叶酸标准液的混合溶液中，37℃静置、暗培养至菌液od600为0.6～0.8之间；

7、③制备指示菌：将步骤②中菌液富集，5000rpm离心10min，弃上清；加入等量的0.9% nacl溶液，振荡悬浮，5000rpm离心10min，弃上清，重复2次；少量多次地加入0.9%nacl溶液，充分混匀，并调整菌液od600为0.8；准确吸取60μl分装至0.2ml无菌ep管中，按照体积比1:1加入灭菌50%甘油，充分混匀，得测定指示菌，-80℃保存备用；

8、2）叶酸标准液制备，利用叶酸标准品经溶解、稀释和标定步骤配制的，浓度为2.0ng/ml、体积为81.1μl/管，4℃保存，按照以下步骤在弱光、无菌环境下进行：

9、①配制叶酸标准贮备液：称取叶酸标准品，使用0.01mol/l氢氧化钠20%乙醇溶液溶解并定容，配制20.0μg/ml叶酸标准贮备液，避光保存于4℃待用；

10、②配制叶酸标准中间液：量取叶酸标准贮备液，使用0.01mol/l氢氧化钠20%乙醇溶液稀释并定容，制得4.0μg/ml叶酸标准中间液，使用0.22μm无菌滤膜过滤，收集滤液于无菌管中，避光保存于4℃待用；

11、③标定叶酸标准中间液：以0.01mol/l氢氧化钠20%乙醇溶液为空白调零，使用紫外分光光度计，于光径1cm比色杯、在256nm条件下，测定3～5次吸光度值，求平均值并按照公式：浓度μg/ml=平均吸光度值/摩尔消光系数24500×叶酸相对分子量441.40×换算系数1000计算，得出叶酸标准中间液的浓度；

12、④叶酸标准液制备：准确量取叶酸标准中间液，使用0.01mol/l氢氧化钠20%乙醇溶液稀释并定容至浓度为2.0ng/ml，精准分装81.1μl至1.5ml避光无菌ep管中、密封，得叶酸标准液，4℃保存备用；

13、3）叶酸测定培养基是利用叶酸测定培养基基质，按照质量比188:1加入了抗坏血酸，质量为1.701g/瓶，4℃保存。

14、一种根据所述的制备方法制备的高效、精准稻米总叶酸检测试剂盒，所述试剂盒包括：1×测定指示菌、1×叶酸标准液、1×叶酸测定培养基、3×无菌水、1×无菌微孔板、1×封板膜、1×无菌滤膜、1×无菌注射器、1×铝箔遮光袋。

15、一种所述的高效、精准稻米总叶酸检测试剂盒的使用方法，按照以下步骤在无菌弱光条件下进行：

16、（1）测定前0.5h，从-80℃和4℃取出测定指示菌和叶酸标准液、叶酸测定培养基、无菌水，置于常温；

17、（2）打开叶酸测定培养基，将18ml无菌水加入瓶中，盖好瓶盖，涡旋充分溶解，沸水浴5min，间隔混匀2～3次，冰上迅速冷却，使用0.22μm无菌滤膜过滤，用无菌离心管收集滤液，待用；

18、（3）取出叶酸标准液，短暂离心，将1.0ml无菌水加入管内，盖紧管盖，充分混匀，待用；

19、（4）取出微孔板，避免污染微孔板和触摸微孔板管底部，将叶酸标准液准确吸取0μl、15μl、30μl、60μl、90μl和150μl分别加入到微孔板的孔底，使用无菌水补至150μl，重复三次，共18孔，即标准样品0、1、2、3、4、5，对应浓度分别为0、0.015、0.030、0.060、0.090和0.15ng/ml；

20、（5）根据稻米叶酸含量范围和提取情况，确定样品叶酸提取物浓度需稀释倍数，将样品叶酸提取物使用无菌水稀释合适倍数，稀释后浓度介于0.015-0.15ng/ml之间至无菌管中，充分混匀，得测试样品，将150μl测试样品依次加入到微孔板的孔底；

21、（6）将测定指示菌混合均匀并短暂离心，加入到新制的叶酸测定培养基，涡旋充分混匀，依次吸取150μl悬空加到含有标准样品或“测试样品的微孔板孔中；

22、（7）将“贴板膜”紧密粘于微孔板表面，禁止触摸膜内侧表面和微孔板底部，密封，水平混匀数次，保持水平状态轻轻装入铝箔遮光袋，37℃静置、暗培养46-48h；

23、（8）培养结束后，置于4℃冰箱冷却15min取出，水平检查微孔板各孔并保持密封，水平用力混匀数十次；

24、（9）从微孔板一侧轻轻揭去贴板膜，避免培养物溅出，操作时保持水平、禁止触摸和污染微孔板底部，放入酶标仪在540-630nm下测定培养物od值；

25、（10）使用数据处理软件，利用标准样品的浓度x与测定的od值y拟合4参数标准曲线，根据测试样品的od值y在标准曲线中求得对应的浓度x，依据样品叶酸提取物稀释倍数与其提取情况以及样品重量信息计算出样品中总叶酸含量。

26、所述的步骤（3）～（6）使用高精准移液器和低吸附枪头。

27、所述的步骤（6）中，测定指示菌与新制叶酸测定培养基的体积比为1:150。

28、所述的步骤（7）在37℃静置、暗培养46h后，进行培养物测定。

29、所述的步骤（9）培养物测定波长选择600nm。

30、所述的步骤（9）设置酶标仪，选择酶标板型号costar 96 flat transparent，设置测定温度25℃，振动环绕120s、线性120s、幅度1mm，测定波长600nm，孔读方式大小3*3、满圆、border为2000μm；孔读次数25、间隔时间20ms。

31、所述的稻米包括糙米、精米。

32、本发明试剂盒的检测原理是：根据叶酸是鼠李糖乳杆菌（atcc7469）生长发育所必须的营养元素，在一定条件下培养基中的总叶酸量与指示菌的生长繁殖呈正比关系，利用指示菌的生长情况（即培养物的浑浊度，od值）对样品的总叶酸含量进行定量分析；具体是指示菌在含有样品和叶酸测定培养基的微孔板中生长，经酶标仪测定od值后，利用“标准样品”测得的od值（y）与对应的浓度（x）来拟合4参数标准曲线（当标准曲线r2≥0.995时符合要求），再根据标准曲线由“测试样品”的od值（y）求得对应的浓度（x），然后依据“样品叶酸提取物”稀释倍数与其提取情况以及样品重量信息计算出样品中总叶酸含量。

33、本发明的微生物法稻米总叶酸含量检测试剂盒，具有以下优点：

34、（1）操作简便、易掌握；

35、（2）检测样本数量多、耗材少；

36、（3）样品用量少、效率高；

37、（4）实验精密度高、重复性好，结果准确可靠。