来源于乳铁蛋白的抗氧化肽及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及来源于乳铁蛋白的抗氧化肽及其应用。

背景技术：

1、随着自由基生物学及医学的发展，自由基及抗氧化剂的研究日益引起人们的重视。活性氧是人体细胞生理代谢副产物，包括羟基自由基、超氧阴离子自由基、单线态氧和过氧化氢等，会被细胞抗氧化系统及时清除(guo y,zhang t,jiang b,et al.the effectsof an antioxidative pentapeptide derived from chickpea protein hydrolysateson oxidative stress in caco-2 and ht-29 cell lines[j].journal of functionalfoods,2014,7:719-726.)。在某些情况下，自由基过量积累会在体内引发氧化应激反应，造成细胞内生物大分子如蛋白质、脂质、dna等的氧化损伤，从而加速机体衰老，引发神经退行性疾病、动脉粥样硬化、慢性炎症、癌症等多种疾病(garcía-nebot m j,recio i,hernández-ledesma b.antioxidant activity and protective effects of peptide lunasinagainst oxidative stress in intestinal caco-2cells[j].food and chemicaltoxicology,2014,65:155-161.)。研究表明，体外摄入抗氧化剂可以清除体内过多的自由基、降低机体氧化应激水平，可以起到预防、甚至治疗某些疾病的作用(he r,ju x,yuan j,et al.antioxidant activities of rapeseed peptides produced by solid statefermentation[j].food research international,2012,49(1):432-438.)。氧化也是造成食品变质，降低营养价值甚至产生有害物质的重要原因之一，因此抗氧化剂在保健品、食品、医药和化妆品领域有广泛的需求。由于合成抗氧化剂的长期摄入对人体健康存在潜在危害，天然食源性抗氧化剂越来越受到青睐(liu c,ren d,li j,et al.cytoprotectiveeffect and purification of novel antioxidant peptides from hazelnut(c.heterophylla fisch)protein hydrolysates[j].journal of functional foods,2018,42:203-215.)。在天然抗氧化剂中，动植物食物蛋白来源抗氧化肽由于其分子量低、活性高、易于吸收、无色无味、无副作用等优点受到广泛关注(mahgoub s,alagawany m,nader m,et al.recent development in bioactive peptides from plant and animalproducts and their impact on the human health[j].food reviews international,2021:1-26.)。抗氧化肽种类众多，分子大小各不相同，溶解性各有差异，为其开发利用提供了更多选择。

2、抗氧化肽的获得主要有以下途径：一是直接从动植物细胞裂解物中筛选；二是以动植物蛋白为原料，选择适当的酶进行水解，采用超滤、色谱等方法对一定分子量的多肽进行分离纯化，并测定对应的分离组分的抗氧化活性；在明确抗氧化肽的序列后可通过分离纯化或合成技术得到大量抗氧化肽；三是采用生物信息学方法对动植物已知序列的蛋白进行分析，预测高活性的多肽片段，并通过化学合成的方法合成，进行活性验证(抗氧化肽的研究现状.)。

3、乳铁蛋白(lactoferrin,lf)是一种由哺乳动物粘膜上皮细胞分泌的非血红素铁结合糖蛋白(mayeur s,spahis s,pouliot y,et al.lactoferrin,a pleiotropicprotein in health and disease[j].antioxidants&redox signaling,2016,24(14):813-836.)，分子量约为80kda，广泛存在于眼泪，唾液，汗液，胃肠液，牛乳和人初乳中，被认为是人和抗感染防御系统的基本要素之一(park j h,park g t,cho i h,et al.anantimicrobial protein,lactoferrin exists in the sweat:proteomic analysis ofsweat[j].experimental dermatology,2011,20(4):369-371.&masson p,heremans j f,prignot j.immunohistochemical localization of the iron-binding proteinlactoferrin in human bronchial glands[j].experientia,1965,21(10):604-605.)。据报道，lf具有抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗癌、抗氧化、抗过敏、消炎及免疫调节等生物学功能(张恩鹏.牛乳铁蛋白肽衍生肽设计及其在毕赤酵母中的表达研究[d].江苏大学,2019.&fan f,shi p,liu m,et al.lactoferrin preserves bone homeostasis by regulatingthe rankl/rank/opg pathway of osteoimmunology[j].food&function,2018,9(5):2653-2660.)。由于lf的好处，常被添加到婴儿配方奶粉、保健品、化妆品、宠物护理补充剂、饮料、发酵乳、口香糖和牙膏等多种产品中，有助于调节铁吸收并保护新生儿胃肠道免受感染(brock j h.lactoferrin in human milk:its role in iron absorption andprotection against enteric infection in the newborn infant[j].archives ofdisease in childhood,1980,55(6):417.)，用于增强机体免疫(wang b,timilsena y p,blanch e,et al.lactoferrin:structure,function,denaturation and digestion[j].critical reviews in food science and nutrition,2019,59(4):580-596.)。同时许多已被证明具有超过整个蛋白的活性，并兼具多种活性功能。例如，lf多肽具有血管紧张素转换酶抑制活性、抗氧化和抗炎活性(ruiz-giménez p,salom j b,marcos j f,etal.antihypertensive effect of a bovine lactoferrin pepsin hydrolysate:identification of novel active peptides[j].food chemistry,2012,131(1):266-273.&gu y,wu j.bovine lactoferrin-derived ace inhibitory tripeptide lrp alsoshows antioxidative and anti-inflammatory activities in endothelial cells[j].journal of functional foods,2016,25:375-384.)。虽然研究表明乳铁蛋白的降解产物保持了抗氧化等生物活性，但利用酶解方法制备活性肽工艺复杂、时间长、成本高、产物组成不均，不同批次质量难以控制，难对其作用机理进行深入研究(张强,李伟华.抗氧化肽的研究现状[j].食品与发酵工业,2021,47(2):298-304.)。因此，有必要使用生物信息学分析来补充研究抗氧化肽的传统方法。然而，基于计算机模拟筛选抗氧化肽，尤其来源于乳铁蛋白的抗氧化肽尚未报道。

技术实现思路

1、本发明采用生物信息学的方法，基于重叠肽库设计乳铁蛋白肽文库，借助anoxpepred-1.0预测和筛选具有较高活性抗氧化肽，可用作食品、化妆品或保健品的添加剂。其中，舍弃传统蛋白分离纯化生物活性肽的方法，采用生物信息学方法设计，从而大大节省实验时间成本和金钱成本。针对传统方法对于抗氧化活性肽缺乏有效发现手段，本发明涉及对具有抗氧化的多肽进行高通量筛选的方法简单而有效，具有独特优势。筛选到的本发明的抗氧化肽来源于乳铁蛋白序列，实现来源良好生物兼容性、绿色、安全的目标。

2、为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

3、本发明提供来源于乳铁蛋白的抗氧化肽，氨基酸序列如seq id no：1至99任一所示。

4、优选地，其氨基酸序列如seqid no:1-2、seqid no.8、seqid no.10、seqid no.15、seqid no.17、seqid no:23-26、seqid no.34、seqid no.37、seqid no.40、seqid no.43、seqid no.48、seqid no.50、seqid no:53-57、seqid no.61、seqid no.64-65、seqidno.68、seqid no:71-73、seqid no.75、seqid no.77、seqid no.79、seqid no:85-88、seqidno:92-94、seqid no.96和seqid no:98-99任一所示。

5、更优选地，其氨基酸序列如其氨基酸序列如seqid no.1、seqid no.23、seqidno.24、seqid no.55、seqid no.61、seqid no.65、seqid no.68、seqid no.73、seqid no.79或seqid no.98。进一步优选地，其氨基酸序列如seqid no.24、seqid no.55、seqid no.73任一所示。

6、本发明也提供编码所述的抗氧化肽的核酸、含所述的核酸的表达载体以及含有所述的表达载体的重组细胞。

7、本发明还提供所述的抗氧化肽或其编码核酸在制备抗氧化产品中的应用。

8、优选地，所述产品是指食品、化妆品或保健品，所述抗氧化肽作为活性成分或添加剂使用。

9、本发明通过创新的采用了重叠肽库设计乳铁蛋白肽文库，实现全序列建立乳铁蛋白肽库，节省了时间和成本，提高了水解产物序列组成的准确度，在生物信息学生物活性肽领域具有独创性。其中通过创新的采用了anoxpepred-1.0服务器预测和筛选具有较高活性乳铁蛋白抗氧化肽，实现了一个高通量筛选乳铁蛋白抗氧化肽的方法，节省了资金和人力，提高了效率，在生物活性肽领域具有独创性。本发明的特点是存在特定的氨基酸序列，其含有半胱氨酸，这些创新肽能很好地清除清除自由基，以提高抗氧化活性，且属于天然抗氧化剂，安全性好。

10、具体地，本发明的提供的创新肽经检测具有优异的抗氧化活性，在本发明测定条件下其dpph自由基清除能力和abts自由基清除能力分别接近或优于谷胱甘肽和肌肽。