一种烟草靶斑病菌检测引物及检测方法和应用与流程

本发明涉及分子生物学，尤其涉及一种烟草靶斑病菌检测引物及检测方法和应用。

背景技术：

1、靶斑病病原菌为瓜亡革菌[thanatephorus cucumeris(frank)donk]，其无性世代为立枯丝核菌(rhizoctonia solani kühn)，病害症状易与常见的烟草赤星病和烟草野火病相混淆，造成误诊，并且病害发生速度快，一旦发生，流行迅速、危害严重，因此，需要通过田间土壤和叶片上病原积累程度与发病临界值准确分析，预测病害发生趋势，为病害防控用药时间提供依据。

2、现有的靶斑病定量检测体系主要是应用探针法进行检测，但是探针法存在合成周期长、合成成本高且无法利用熔解曲线分析定量结果的可信度等缺点。

3、因此，目前急需寻找一种合成成本低、可利用熔解曲线判定定量结果的烟草靶斑病检测方法，对烟草靶斑病进行快速检测、从而进行提前防治，降低经济损失。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明的目的是提供一种烟草靶斑病菌检测引物及检测方法和应用，解决检测烟草靶斑病时合成周期长，合成成本高且无法利用溶解曲线分析定量结果的可信度的问题。

2、本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

3、一种烟草靶斑病菌检测引物，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列为：5′-tgtgaacttgtgagacagttgggg-3′(序列1)，所述反向引物的核苷酸序列为：5′-caaggaataccaaggagcgcaag-3′(序列2)。

4、本发明还公开了应用上述烟草靶斑病菌检测引物建立的一种烟草靶斑病菌的检测方法，所述检测方法如下：

5、a：烟草靶斑病菌基因组dna提取：采集靶斑病侵染后的叶片提取dna，得到烟草靶斑病菌基因组dna；

6、b：模板制备：以烟草靶斑病菌基因组dna为模板，用烟草靶斑病菌特异性引物进行常规pcr扩增，得到276bp的pcr产物，将pcr产物进行凝胶电泳后胶回收，连接到ptopo-blunt simple载体上，并转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，挑取阳性菌落过夜培养；

7、c：标准曲线绘制：提取含有目的dna片段的大肠杆菌标准质粒，以10倍梯度稀释后的标准质粒作为扩增模板进行q-pcr扩增，以拷贝数的对数(lgct)为横坐标，循环阈值(ct)为纵坐标制作标准曲线，根据标准曲线所得数据分析拷贝数与ct值之间的关系，并建立数学模型，检验相关性；

8、d：烟草靶斑病实时荧光定量pcr检测：以待测样品dna为模板，利用正、反向引物进行pcr扩增，将测定样品dna的ct值代入建立的标准曲线中，即可得到烟草靶斑病菌量，在ct值为20.34时，靶斑病菌含量为12.01pg·μl-1，达到烟草靶斑病的最低发病菌量。

9、进一步，所述步骤b中凝胶电泳浓度为2％。

10、进一步，所述步骤b中过夜培养温度为37℃。

11、进一步，所述步骤d中pcr扩增体系为sybr green i实时荧光定量pcr检测体系。

12、相较于普通pcr，利用sybr green i实时荧光定量pcr检测体系，实时荧光定量pcr能够检测到浓度为1×10-3ng·μl-1的标准质粒，是常规pcr灵敏度的100倍，提高对烟草靶斑病的检测灵敏度。

13、进一步，所述步骤d中sybr greenⅰ荧光定量pcr扩增反应体系为：2×sybr荧光定量混合液10μl，10μmol/l正、反向引物各1μl，待测dna样品1μl，ddh2o补足至20μl。

14、进一步，所述步骤d中sybr greenⅰ荧光定量pcr扩增反应条件为：98℃预变性30s；扩增循环40×(98℃10s，55℃10s，72℃10s)；72℃延伸10min。

15、进一步，所述步骤d中pcr扩增产物长度为276bp。

16、进一步，所述烟草靶斑病菌检测引物在检测烟草靶斑病菌中的应用。

17、有益效果：

18、1.本发明公开的一种烟草靶斑病菌检测引物及检测方法和应用，公开的引物在检测烟草靶斑病菌时，特异性强，灵敏度高，可以很好的对烟草靶斑病菌进行检测。

19、2.本发明公开的一种烟草靶斑病菌检测引物及检测方法和应用，通过以田间待测烟草dna为模板，利用正、反向引物进行pcr扩增，将测定样品dna的ct值代入建立好的标准曲线中，得到靶斑病菌量，可在烟草达到最低发病菌量之前施药进行预防，为烟草靶斑病菌病害的发生提供早期预警，早期防治后用药少，防治效果明显，该引物在烟草靶斑病害预测预报中有非常好的应用前景。

20、3.本发明公开的一种烟草靶斑病菌检测引物及检测方法和应用，设计了实时荧光定量检测引物，实时荧光定量检测引物合成成本低，可利用熔解曲线判定定量结果的可信度，利用该引物对田间烟草靶斑病高发地进行检测，可对烟草靶斑病发生节点进行较为准确的预测，对烟草靶斑病快速检测、提前防治以及降低经济损失具有重要意义。

技术特征：

1.一种烟草靶斑病菌检测引物，其特征在于，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如序列1所示，所述反向引物的核苷酸序列如序列2所示。

2.应用权利要求1所述引物建立的烟草靶斑病菌检测方法，其特征在于，所述方法如下：

3.根据权利要求2所述的一种烟草靶斑病菌检测方法，其特征在于，所述步骤b中凝胶电泳时凝胶浓度为2％。

4.根据权利要求3所述的一种烟草靶斑病菌检测方法，其特征在于，所述步骤b中过夜培养温度为37℃。

5.根据权利要求4所述的一种烟草靶斑病菌检测方法，其特征在于，所述步骤d中pcr扩增体系为sybr green i实时荧光定量pcr检测体系。

6.根据权利要求5所述的一种烟草靶斑病菌检测方法，其特征在于，所述步骤d中sybrgreenⅰ荧光定量pcr扩增反应体系为：2×sybr荧光定量混合液10μl，10μmol/l正、反向引物各1μl，待测dna样品1μl，ddh2o补足至20μl。

7.根据权利要求6所述的一种烟草靶斑病菌检测方法，其特征在于，所述步骤d中sybrgreenⅰ荧光定量pcr扩增反应条件为：98℃预变性30s；扩增循环40×(98℃10s，55℃10s，72℃10s)；72℃延伸10min。

8.根据权利要求7所述的一种烟草靶斑病菌检测方法，其特征在于，所述步骤d中pcr扩增产物长度为276bp。

9.如权利要求1所述烟草靶斑病菌检测引物在检测烟草靶斑病菌中的应用。

技术总结
本发明公开了一种烟草靶斑病菌检测引物及检测方法和应用，属于分子生物学技术领域，所述引物包括正向引物：5′‑TGTGAACTTGTGAGACAGTTGGGG‑3′，反向异物：5′‑CAAGGAATACCAAGGAGCGCAAG‑3′，先建立标准曲线，然后以待测样品DNA为模板，利用正、反向引物进行SYBRGreenⅠ荧光定量PCR扩增，然后将测定样品DNA的Ct值代入建立好的标准曲线中，算出靶斑病菌量，从而在烟草达到最低发病量前，施药预防烟草靶斑病的扩散和发展，对烟草靶斑病的快速检测、提前防治以及降低经济损失具有重要意义。

技术研发人员：王红锋,孙现超,冉茂,李凤巍,裴悦宏,陈海涛,耿莉娜
受保护的技术使用者：中国烟草总公司重庆市公司烟叶分公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12