一种促进胞苷合成的方法及应用与流程

本发明涉及一种促进胞苷合成的方法及应用，属于基因工程和微生物工程领域。

背景技术：

1、1-β-d-呋喃核苷胞嘧啶(1-beta-ribofuranosylcytosine)又名胞嘧啶核苷(cytosine nucleoside)、胞苷(cytidine)。胞苷是由胞嘧啶的n-1与d-核糖的c-1通过β糖苷键相连接形成的化合物。胞苷存在于一切生物体内，是rna的组成部分。胞苷最重要的工业用途是作为化学合成抗病毒、抗肿瘤药物的原料。许多胞苷结构类似物，都具有干扰细胞rna合成的作用。基于这一原理，已开发出了多种胞苷类似物，用于治疗病毒感染和肿瘤，其中许多药物被作为临床特效药和首选药物而广泛使用。例如：扎西他滨(2'，3'-双脱氧胞嘧啶核苷)，能够竞争性的抑制逆转录酶活性，被广泛用于治疗hiv感染和其它逆转录病毒感染。卡培他滨(5'-脱氧-5-氟-n-[(戊氧基)羰基]胞苷)，也是一种胞苷类似物，在临床上用于治疗肠癌、胃癌、肝癌和乳腺癌等多种肿瘤。这些胞苷结构类似物都是重要的临床药物，都是以胞苷为原料，通过化学合成生产。因此，胞苷是重要的医药中间体。

2、目前为止，胞苷的工业生产方法包括rna水解法、化学合成法和微生物发酵法三种。rna水解法生产胞苷虽然有技术简单、容易操作和控制等优点，但是对原料要求较高，工艺过程复杂，产品收率低，生产成本过高，目前已基本被其它方法所替代。已开发出了数十种化学合成法生产胞苷的工艺技术，最新的胞苷合成工艺是用双对硝基酚磷酸酯为催化剂，催化n4-乙酰胞嘧啶和四-o-乙酰基-β-d-呋喃核糖反应，经脱除乙酰基，生成胞苷。化学合成法生产胞苷的技术发展至今，显著降低了胞苷的价格。但是，化学合成法固有的反应路线长、反应条件苛刻、催化剂价格昂贵、副产品多以及潜在的环境污染等特点所限，进一步降低生产成本几乎不可能。由于胞苷生产成本的问题，限制了其在医药领微生域物和发其酵它法用生途产的胞应苷用包。括添加前体物发酵法和直接发酵法。添加前体物发酵法生产胞苷主要是利用胞苷合成的补救途径，胞苷合成的补救途径是指培养基中补加的尿嘧啶与微生物细胞内的5-磷酸核糖焦磷酸(prpp)，在尿嘧啶核糖磷酸转移酶(pyrr/upp)的催化下直接生成ump，然后经过udp、utp、ctp生成胞苷。直接发酵法胞苷，主要是利用微生物的ump的“从无到有”生成ump，然后再经udp、utp、ctp生成胞苷。利用微生物的补救途径发酵生产胞苷，需要尿嘧啶作为发酵的前体物，造成原料成本高，生产效率低，不是技术发展的方向。而直接发酵法可通过微生物遗传育种技术，选育高产胞苷的发酵菌种，以葡萄糖为主要原料，在温和的条件下，经过相对简单的工艺，生产高质量的胞苷。直接发酵法能够进一步降低胞苷的生产成本，生产过程相对环境友好，技术提升空间较大。

3、cn106754602a披露了一种生产胞苷的重组微生物及生产胞苷的方法，敲除了胞苷脱氨酶、核糖核苷水解酶、胞苷/尿苷激酶、核苷转运蛋白，同时过量表达了胞苷三磷酸焦磷酸化酶、胞苷单磷酸磷酸化酶，解除嘧啶核苷途径的反馈抑制，构建了一株重组大肠杆菌，其在5l发酵罐可达20g/l的胞苷生产水平。但该方法构建的菌株在发酵时需要添加抗生素，且在发酵生产胞苷时，需要添加诱导剂iptg，且产量不高。该诱导剂和抗生素价格昂贵且对细胞有毒性，同时如果胞苷的积累浓度进一步获得提高，将进一步促进其工业化生产。

4、本发明要解决的技术问题是现有技术中缺少可高产胞苷的重组菌株，特别是缺少在不添加诱导剂和抗生素的条件下高产胞苷的重组菌株。

技术实现思路

1、本发明提供了一种重组大肠杆菌，敲除了基因组上的胞苷脱氨酶基因cdd、尿苷激酶基因udk、嘧啶特异性核糖核苷水解酶基因rihb、核苷酸5’-单磷酸核苷酶基因ppnn，并整合表达5’-ctp二磷酸水解酶和/或乳清酸磷酸核糖转移酶。

2、在一种实施方式中，所述胞苷脱氨酶基因cdd的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述尿苷激酶基因udk的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述嘧啶特异性核糖核苷水解酶基因rihb的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述核苷酸5’-单磷酸核苷酶基因ppnn的核苷酸序列如seq id no.4所示。

3、在一种实施方式中，所述5’-ctp二磷酸水解酶具有seq id no.6所示的氨基酸序列。

4、在一种实施方式中，所述乳清酸磷酸核糖转移酶的氨基酸序列如seq id no.8或seq id no.10所示。

5、在一种实施方式中，在umph位点整合5’-ctp二磷酸水解酶基因；所述5’-ctp二磷酸水解酶的基因序列如seq id no.5所示。

6、在一种实施方式中，在umph位点整合乳清酸磷酸核糖转移酶基因pyre和/或pyre/k26h；所述乳清酸磷酸核糖转移酶基因pyre的基因序列如seq id no.7所示；所述pyre/k26h的基因序列如seq id no.9所示。

7、本发明还提供一种促进胞苷合成的方法及应用，是敲除大肠杆菌或枯草芽孢杆菌基因组上的胞苷脱氨酶基因cdd，敲除尿苷激酶基因udk，敲除嘧啶特异性核糖核苷水解酶基因rihb，敲除核苷酸5’-单磷酸核苷酶基因ppnn，并整合表达5’-ctp二磷酸水解酶基因nudg和/或乳清酸磷酸核糖转移酶基因pyre或其酶突变体基因pyre/k26h，促进胞苷高效积累。

8、在一种实施方式中，所述大肠杆菌选自：dh5α、bl21(de3)、jm109、hb101或mg1655。本发明还提供一种发酵生产胞苷的方法，是将所述重组大肠杆菌在含葡萄糖的培养基中发酵。

9、在一种实施方式中，所述发酵过程不添加任何抗生素和诱导剂(iptg)。

10、在一种实施方式中，所述发酵是将菌株接种至lb培养基中，37℃和200rpm，培养5-15h；对于摇瓶发酵，按照0.1-10％接种量接种至含有50-150ml lb培养基的500ml三角瓶中，37℃和200rpm，培养40-75h。

11、在一种实施方式中，所述发酵是将lb培养基中的种子液按照0.5-15％接种量，转接至发酵培养基中，在35℃和200rpm条件下进行发酵培养，控制发酵过程中葡萄糖浓度为15±2g/l，控制溶氧为25％；当溶氧低于25％，提高搅拌转速、通气量和罐压；发酵过程采用氨水控制ph为6-8。

12、在一种实施方式中，用于发酵的培养基含有：葡萄糖12-85g/l、mgso4 0.5-5g/l、柠檬酸钠1.6-19mg/l、氯化钙7-560mg/l、磷酸氢二钠0.1-7.9g/l、磷酸二氢钠0.6-10.3g/l、氯化锌0.7-72mg/l、酵母粉0.3-11g/l、蛋白胨0.5-21g/l、氯化铜5-145mg/l、硫酸锌1-9.2mg/l、钼酸钠1.3-165mg/l。

13、在一种实施方式中，发酵过程还进行补料；所述补料培养基含有：葡萄糖350-820g/l、蛋白胨0.5-20g/l、酵母粉0.5-20g/l。

14、本发明还提供所述重组大肠杆菌在发酵生产胞苷方面的应用。

15、有益效果：

16、(1)本发明采用基因敲除技术敲除胞苷脱氨酶基因cdd阻断胞苷至尿苷的途径，敲除尿苷激酶基因udk阻断胞苷至cmp的途径，敲除嘧啶特异性核糖核苷水解酶基因rihb阻断胞苷至胞嘧啶的途径，核苷酸5’-单磷酸核苷酶基因ppnn阻断cmp至胞嘧啶的途径，整合表达5’-ctp二磷酸水解酶基因nudg，表达乳清酸磷酸核糖转移酶基因pyre或其酶突变体基因pyre/k26h减少中间代谢产物乳清酸的积累，可以高效生产胞苷。发酵48h时，在30l发酵罐中产量达到45.3g/l，基本不积累中间代谢产物，有利于胞苷的分离纯化。

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19、(2)本发明提供的重组大肠杆菌，能够以葡萄糖为底物，在不补加诱导剂iptg和抗生素的条件下，一步发酵得到胞苷，发酵上清液中胞苷浓度高，便于分离纯化，工艺简单，可用于实现胞苷的工业化生产，利于降低其生产成本及环境污染，实现绿色生物制造。