基于微球固相PCR技术实现核酸绝对定量的核酸扩增方法

本发明属于生物，涉及一种核酸扩增方法，具体涉及一种基于微球固相pcr技术实现核酸绝对定量的核酸扩增方法。

背景技术：

1、聚合酶链式反应(pcr)是一种体外放大特定核酸的反应，在疾病诊断、现场取证等方面具有重要的应用领域。目前rna分子定量检测的常见方法有real time q-pcr和数字pcr两种，而real time q-pcr只能进行相对定量的分析，并不能精确反应样本中rna的实际数量。数字pcr是最新的一种绝对定量技术，使用微流控或微滴化的方法使单个微滴的核酸模板数少于或等于1个，有模板的微滴通过pcr反应产生荧光信号，通过数荧光信号既能得到样本的rna个数。由于数字pcr的仪器昂贵、配套试剂耗材成本高，因此还未能被广泛应用。因此，开发一种快速检测、经济、便捷的核酸绝对定量方法仍被迫切需要。

技术实现思路

1、为了克服real time q-pcr结果精确度不高和数字pcr成本昂贵的问题，本发明的目的是提供一种基于微球固相pcr技术实现核酸绝对定量的核酸扩增方法，通过读取微球核酸荧光信号数目得到样本初始核酸浓度。

2、本发明采用的具体方案为：

3、基于微球固相pcr技术实现核酸绝对定量的核酸扩增方法，包括以下步骤：

4、步骤一、制备引物微球复合物：根据靶序列设计引物，在上游引物和下游引物的5’端均修饰功能基团ⅰ；在微球表面修饰有与功能基团ⅰ偶联的功能基团ⅱ；通过偶联将引物连接在微球上，制备引物微球复合物；

5、步骤二、采用引物微球复合物代替引物，通过常规pcr/rt-pcr方法进行核酸扩增，将目标核酸在微球表面进行扩大复制，使微球表面固定的扩增产物达到被检测的数量；

6、步骤三、对扩增反应后微球上的扩增产物进行检测，通过计数的方式进行核酸分子的绝对定量。

7、优选地，步骤一中，所述微球为聚合物或无机材料微球。进一步地，所述微球为聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球或磁性微球。

8、优选地，步骤一中，所述微球的直径大小为0.1-30μm，优选为0.2-5μm。

9、优选地，步骤二中，所述核酸扩增的体系中，微球浓度为102-105个/μl，优选103个/μl。

10、优选地，所述检测为基于核酸杂交的固相检测、基于荧光的微球计数法或电化学检测。更进一步地，所述检测方法是对微球上的扩增产物进行核酸染料染色、使用带荧光标记的dntp渗入产物链中进行标记或使用带电化学/化学信号分子标记的dntp渗入产物链中进行标记。

11、优选地，步骤一中，所述偶联方式为羧基与氨基偶联、巯基与氨基偶联。进一步地，所述功能基团ⅰ为氨基，所述功能基团ⅱ为羧基，两者进行共价偶联。

12、优选地，步骤一中，所述靶序列为结核杆菌is6110的dna序列，上游引物是在seqid no：1所示序列的5’端修饰氨基，下游引物是在seq id no：2所示序列的5’端修饰氨基。

13、优选地，步骤一中，所述靶序列为新冠病毒n蛋白的rna序列，上游引物是在seq idno：3所示序列的5’端修饰氨基，下游引物是在seq id no：4所示序列的5’端修饰氨基。

14、有益效果：本发明将引物偶联在固相微球上，制备引物微球复合物，采用所述引物微球复合物代替引物进行核酸扩增，最后通过计数带有扩增产物的微球，即可实现核酸的绝对定量。

技术特征：

1.基于微球固相pcr技术实现核酸绝对定量的核酸扩增方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤一中，所述微球为聚合物或无机材料微球。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤一中，所述微球的直径大小为0.1-30μm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤二中，所述核酸扩增的体系中，微球浓度为102-105个/μl。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤三中，所述检测为基于核酸杂交的固相检测、基于荧光的微球计数法或电化学检测。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述检测是对微球上的扩增产物进行核酸染料染色、使用带荧光标记的dntp渗入产物链中进行标记或使用带电化学/化学信号分子标记的dntp渗入产物链中进行标记。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤一中，所述偶联方式为羧基与氨基偶联、巯基与氨基偶联。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述功能基团ⅰ为氨基，所述功能基团ⅱ为羧基，两者进行共价偶联。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤一中，所述靶序列为结核杆菌is6110的dna序列，上游引物是在seq id no：1所示序列的5’端修饰氨基，下游引物是在seq idno：2所示序列的5’端修饰氨基。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤一中，所述靶序列为新冠病毒n蛋白的rna序列，上游引物是在seq id no：3所示序列的5’端修饰氨基，下游引物是在seq idno：4所示序列的5’端修饰氨基。

技术总结
本发明涉及基于微球固相PCR技术实现核酸绝对定量的核酸扩增方法，属于生物技术领域，本发明根据所需检测的基因进行引物设计，并在上游引物和下游引物的5’端处用功能基团修饰，通过共价偶联引物，制备引物微球复合物。对所需检测的样品进行核酸提取，并使用微量分光光度计进行纯度和浓度测定。按照常规PCR/RT‑PCR试剂盒配制扩增体系，使用普通PCR仪器进行扩增。扩增后观察并计数带有扩增产物的微球，从而实现核酸的绝对定量。

技术研发人员：钟家本,张航艳,张艺瀚,蔡伊娜,陈秀萍,方志远,卢宇靖
受保护的技术使用者：广东工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13