本发明涉及领域,具体地,涉及引物及其和探针的组合物在制备检测hpv的试剂盒中的应用。
背景技术:
1、宫颈癌是常见的女性妇科恶性肿瘤,患病率居女性生殖道恶性肿瘤的首位。全世界范围内每年有超过50万例新发宫颈癌确诊病例,超过30万人死于这种恶性肿瘤。据估计,在中国宫颈癌每年约有13.2万新发病例,占全球宫颈癌新发病例总数的四分之一,且发病呈明显年轻化趋势。而宫颈癌也是目前仅有的一种病因明确且三级预防手段完善的恶性肿瘤。高危型人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,hpv)持续感染是导致宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的主要原因。全球范围的研究结果显示,在99.7%的宫颈癌患者体内检测到高危型hpv dna的存在。目前已知有一百多种不同类型的hpv,其中大部分被视为“低风险”,与宫颈癌并无关联,但有14种hpv类型(hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68型)被列为“高风险”。国际癌症研究协会已经评价并确定,几乎所有的宫颈癌均由这14种高危型hpv感染引起。其中,两种风险最高的病毒株hpv16和hpv18可导致约70%的宫颈癌病例。
2、根据世界卫生组织(who)估计,若缺乏适当有效的筛查方法及预防措施,到2025年,亚洲宫颈癌发病率将上升40%。从最初的高危型hpv的持续感染,发展到宫颈上皮瘤样病变,最终发展为宫颈癌,大约需要5~10年。有文献报道,早期宫颈癌患者的5年治愈率可高达90%,所以早发现、早诊断、早治疗对宫颈上皮内瘤变的患者有重大意义。建立以宫颈癌筛查为目的针对高危型hpv的检测方法,对宫颈癌的预防、诊断和治疗具有重要的意义。
3、现有的宫颈癌筛查方法主要包括细胞学检查,阴道镜病理活检,hpv病毒检测三种。初步筛查一般选取细胞学检查和hpv病毒检测。
4、细胞学检查是宫颈癌筛查的“金标准”,已在全球沿用75年,典型代表技术为传统巴氏涂片(cv)和液基薄层细胞学技术(tct)。但即便是“金标准”,细胞学检查也只能发现约50%的宫颈癌前病变。有研究表明,hpv16或18型检测为阳性,即便细胞学结果正常,每10位女性中仍会有1人存有宫颈癌前病变。所以,单一的细胞学检查还不足以评估女性罹患宫颈癌的风险,hpv检测会有助于宫颈癌筛查。
5、阴道镜检查可实时可视化评估宫颈,尤其是宫颈转化区,以发现宫颈上皮内瘤变或鳞状上皮内病变(sil)和浸润癌。它是对异常宫颈癌筛查结果初始评估的重要一步,可评估宫颈癌前病变的风险。阴道镜检查需要经过充分训练和有经验医师才能胜任,结果的判定具有主观性和不精确性,假阴性率(遗漏高级别病变或浸润癌的比例)为13%~69%。因而,阴道镜病理活检不适用于临床上的大规模初步筛查。
6、现有的hpv病毒检测包括免疫学检测和核酸检测。免疫学检测的方法,如免疫沉淀法、elisa、杂交捕获法等,由于存在检测灵敏度低、假阳性率高、特异性低、操作繁琐、且不便于hpv分型等缺点,限制了其在临床上的大规模应用。2021年who发布的最新宫颈癌前病变筛查和治疗指南中,推荐hpv-dna检测作为宫颈癌初筛首选方法。传统的dna检测方法,包括测序法、原位杂交法、pcr法(电泳鉴定结果)等,结果相对准确,但检测灵敏度低、操作繁琐、耗时久、扩增后的产物暴露易造成交叉污染,不适用于临床上的大规模应用。而在传统的pcr基础上发展起来的实时荧光pcr技术不但灵敏度高、特异性强,自动化程度高,成本适中,几乎不会造成污染,还可以进行hpv分型,这些优点无疑给人乳头瘤病毒的早期诊断带来了福音。
7、当前,亟需建立检测灵敏度高、特异性强、假阴性率低、耗时短、操作便捷的高危型hpv-dna快速检测方法。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中存在的问题,本发明提供了引物及其和探针的组合物在制备检测hpv的试剂盒中的应用。
2、本发明的第一个目的是提供引物在制备检测hpv的试剂盒中的应用。
3、本发明的第二个目的是提供引物和探针的组合物在制备检测hpv的试剂盒中的应用。
4、本发明的第三个目的是提供一种检测hpv的试剂盒。
5、为了实现上述目的,本发明是通过以下方案予以实现的:
6、本发明针对hpv16、hpv18、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66和hpv68,共14种高危型hpv的l1基因,提供特异性的检测引物和探针。国际癌症研究协会已经评价并确定,几乎所有的宫颈癌均由这14种高危型hpv感染引起,所以检测这14种hpv可以有效地进行大规模的宫颈癌初步筛查。
7、一种检测hpv的引物,所述引物的核苷酸序列如seq id no:15~42所示。
8、引物在制备检测hpv的试剂盒中的应用,所述引物的核苷酸序列如seq idno:15~42所示。
9、所述hpv为hpv16、hpv18、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66和hpv68。
10、检测hpv16的引物的核苷酸序列如seq id no:15~16所示;
11、检测hpv18的引物的核苷酸序列如seq id no:17~18所示;
12、检测hpv31的引物的核苷酸序列如seq id no:19~20所示;
13、检测hpv33的引物的核苷酸序列如seq id no:21~22所示;
14、检测hpv35的引物的核苷酸序列如seq id no:23~24所示;
15、检测hpv39的引物的核苷酸序列如seq id no:25~26所示;
16、检测hpv45的引物的核苷酸序列如seq id no:27~28所示;
17、检测hpv51的引物的核苷酸序列如seq id no:29~30所示;
18、检测hpv52的引物的核苷酸序列如seq id no:31~32所示;
19、检测hpv56的引物的核苷酸序列如seq id no:33~34所示;
20、检测hpv58的引物的核苷酸序列如seq id no:35~36所示;
21、检测hpv59的引物的核苷酸序列如seq id no:37~38所示;
22、检测hpv66的引物的核苷酸序列如seq id no:39~40所示;
23、检测hpv68的引物的核苷酸序列如seq id no:41~42所示。
24、一种检测检测hpv的引物和探针的组合物,所述引物为上述引物;所述探针的核苷酸序列如seq id no:1~14所示。
25、引物和探针的组合物在制备检测hpv的试剂盒中的应用,所述引物为上述引物;所述探针的核苷酸序列如seq id no:1~14所示。
26、检测hpv16的探针的核苷酸序列如seq id no:1所示;
27、检测hpv18的探针的核苷酸序列如seq id no:2所示;
28、检测hpv31的探针的核苷酸序列如seq id no:3所示;
29、检测hpv33的探针的核苷酸序列如seq id no:4所示;
30、检测hpv35的探针的核苷酸序列如seq id no:5所示;
31、检测hpv39的探针的核苷酸序列如seq id no:6所示;
32、检测hpv45的探针的核苷酸序列如seq id no:7所示;
33、检测hpv51的探针的核苷酸序列如seq id no:8所示;
34、检测hpv52的探针的核苷酸序列如seq id no:9所示;
35、检测hpv56的探针的核苷酸序列如seq id no:10所示;
36、检测hpv58的探针的核苷酸序列如seq id no:11所示;
37、检测hpv59的探针的核苷酸序列如seq id no:12所示;
38、检测hpv66的探针的核苷酸序列如seq id no:13所示;
39、检测hpv68的探针的核苷酸序列如seq id no:14所示。
40、优选地,所述组合物包含组a~c,所述组合物包含组a~c,各组间的探针的5’端设有不同的荧光报告基团,3’端设有荧光淬灭基团;所述荧光报告基团为texas red、vic或fam中的任意一种;所述荧光淬灭基团为bhq1、bhq2或dq1中的任意一种;
41、所述组a包含核苷酸序列如seq id no:1所示的探针及核苷酸序列如seq id no:15~16所示的引物;所述组b包含核苷酸序列如seq id no:2所示的探针及核苷酸序列如seq id no:17~18所示的引物;所述组c包含核苷酸序列如seq id no:3~18所示的探针及核苷酸序列如seq id no:19~42所示的引物。
42、所述组a检测hpv16,所述组b检测hpv18,所述组c检测其余12种hpv,所述其余12种hpv为hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66和hpv68。
43、更优选地,所述组a的5’端设有荧光报告基团texas red;所述组b的5’端设有荧光报告基团vic;所述组c的5’端设有荧光报告基团fam。
44、更优选地,所述组a的3’端设有荧光淬灭基团bhq2;所述组b的3’端设有荧光淬灭基团bhq1;所述组c的3’端均设有荧光淬灭基团bhq1。
45、一种检测hpv的试剂盒,包含上述核苷酸序列如seq id no:15~42所示的引物。
46、优选地,包含任一上述引物和探针的组合物,所述引物的核苷酸序列如seq idno:15~42所示;所述探针的核苷酸序列如seq id no:1~14所示。
47、更优选地,所述组合物包含组a~c,各组间的探针的5’端设有不同的荧光报告基团,3’端设有荧光淬灭基团;所述荧光报告基团为texas red、vic或fam中的任意一种;所述荧光淬灭基团为bhq1、bhq2或dq1中的任意一种;
48、所述组a包含核苷酸序列如seq id no:1所示的探针及核苷酸序列如seq id no:15~16所示的引物;所述组b包含核苷酸序列如seq id no:2所示的探针及核苷酸序列如seq id no:17~18所示的引物;所述组c包含核苷酸序列如seq id no:3~18所示的探针及核苷酸序列如seq id no:19~42所示的引物。
49、进一步优选地,所述组a的5’端设有荧光报告基团texas red;所述组b的5’端设有荧光报告基团vic;所述组c的5’端设有荧光报告基团fam。
50、进一步优选地,所述组a的3’端设有荧光淬灭基团bhq2;所述组b的3’端设有荧光淬灭基团bhq1;所述组c的3’端均设有荧光淬灭基团bhq1。
51、更进一步优选地,所述组a~c的探针终浓度为0.10μm~0.42μm;所述组a~c的引物终浓度为0.08μm~0.62μm。
52、最优选地,组a中,核苷酸序列如seq id no:1所示的探针终浓度为0.10μm,核苷酸序列如seq id no:15~16所示的引物终浓度为0.20μm;
53、组b中,核苷酸序列如seq id no:2所示的探针终浓度为0.20μm,述核苷酸序列如seq id no:17~18所示的引物终浓度为0.40μm;
54、组c中,核苷酸序列如seq id no:3所示的探针终浓度为0.14μm,核苷酸序列如seqid no:19~20所示的引物终浓度为0.26μm;
55、核苷酸序列如seq id no:4所示的探针终浓度为0.20μm,核苷酸序列如seq idno:21~22所示的引物终浓度为0.40μm;
56、核苷酸序列如seq id no:5所示的探针终浓度为0.12μm,核苷酸序列如seq idno:23~24所示的引物终浓度为0.26μm;
57、核苷酸序列如seq id no:6所示的探针终浓度为0.20μm,核苷酸序列如seq idno:25~26所示的引物终浓度为0.40μm;
58、核苷酸序列如seq id no:7所示的探针终浓度为0.20μm,核苷酸序列如seq idno:27~28所示的引物终浓度为0.40μm;
59、核苷酸序列如seq id no:8所示的探针终浓度为0.20μm,核苷酸序列如seq idno:29~30所示的引物终浓度为0.30μm;
60、核苷酸序列如seq id no:9所示的探针终浓度为0.40μm,核苷酸序列如seq idno:31~32所示的引物终浓度为0.60μm;
61、核苷酸序列如seq id no:10所示的探针终浓度为0.20μm,核苷酸序列如seq idno:33~34所示的引物终浓度为0.30μm;
62、核苷酸序列如seq id no:11所示的探针终浓度为0.12μm,核苷酸序列如seq idno:35~36所示的引物终浓度为0.30μm;
63、核苷酸序列如seq id no:12所示的探针终浓度为0.20μm,核苷酸序列如seq idno:37~38所示的引物终浓度为0.30μm;
64、核苷酸序列如seq id no:13所示的探针终浓度为0.22μm,核苷酸序列如seq idno:39~40所示的引物终浓度为0.24μm;
65、核苷酸序列如seq id no:14所示的探针终浓度为0.20μm,核苷酸序列如seq idno:41~42所示的引物终浓度为0.10μm。
66、优选地,所述组合物还包含组d,所述组d包含检测内参基因的引物和探针。本发明对检测上述14种hpv所用的内参基因不做特殊限定,如gapdh、β-actin、18s rna等常规的内参基因,均可作为检所用的内参基因。
67、更优选地,所述内参基因为gapdh基因。
68、进一步优选地,组d包含检测gapdh基因的核苷酸序列如seq id no:43所示的探针和核苷酸序列如seq id no:44~45所示的引物。
69、更进一步优选地,组d中,所述核苷酸序列如seq id no:44~45所示的引物终浓度为0.18μm~0.22μm。
70、最优选地,组d中,所述核苷酸序列如seq id no:44~45所示的引物终浓度为0.20μm。
71、更进一步优选地,组d中,所述核苷酸序列如seq id no:43所示的探针的5’端设有荧光报告基团cy5,3’端设有荧光淬灭基团eclipse和4*zip。
72、再进一步优选地,组d中,所述核苷酸序列如seq id no:43所示的探针的终浓度为0.28μm~0.32μm。
73、最优选地,组d中,所述核苷酸序列如seq id no:43所示的探针的终浓度为0.30μm。
74、优选地,所述试剂盒还包含阳性质控品,所述阳性质控品为假病毒,所述假病毒的基因组包含核苷酸序列如seq id no:46、seq id no:47和seq id no:54所示的序列。
75、优选地,所述试剂盒还包含阴性质控品,所述阴性质控品为纯化水。
76、优选地,所述试剂盒还包含荧光定量pcr反应试剂。
77、更优选地,所述荧光定量pcr反应试剂包含pcr buffer和pcr酶。
78、进一步优选地,所述试剂盒的使用方法包括如下步骤:
79、s1.获得检测样本的基因组dna;
80、s2.以检测样本的dna作为模板,使用上述引物和探针的组合物、阴性质控品、阳性质控品和荧光定量pcr试剂制备反应体系,进行荧光定量pcr扩增,获得texas red通道、vic通道、fam通道和cy5通道的ct值,判定检测样本中是否含有高危型人乳头瘤病毒;
81、所述判定的方法如下:
82、texas red通道、vic通道和fam通道中至少一个通道的ct值≤38,cy5通道有或无ct值均不影响结果判断;
83、阳性质控品的texas red通道、vic通道和fam通道均为ct值≤38,阴性质控品的cy5通道ct值≤38且texas red通道、vic通道和fam通道均为ct值>38或无ct值,检测样本的texas red通道、vic通道、fam通道和cy5通道至少一个通道有明显扩增曲线,表明检测结果有效,进行下一步感染情况的判定;否则检测结果无效,需要重新检测。
84、感染情况的判定:
85、检测样本的cy5通道ct值≤38且texas red通道、vic通道和fam通道均为ct值>38或无ct值,表明检测样本未感染hpv16、hpv18、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66和hpv68;
86、检测样本的texas red通道ct值≤38,vic通道和fam通道ct值>38或无ct值,表明检测样本感染hpv16,未感染hpv18、hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82;
87、检测样本的vic通道ct值≤38,texas red通道和fam通道ct值>38或无ct值,表明检测样本感染hpv18,未感染hpv16、hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82;
88、检测样本的fam通道ct值≤38,texas red通道和vic通道ct值>38或无ct值,表明检测样本感染hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82中的至少一种,未感染hpv16和hpv18;
89、检测样本的texas red通道和vic通道ct值≤38,fam通道ct值>38或无ct值,表明检测样本感染hpv16和hpv18,未感染其余12种hpv(hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82);
90、检测样本的texas red通道和fam通道ct值≤38,vic通道ct值>38或无ct值,表明检测样本感染hpv16,感染hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82中的至少一种,未感染hpv18;
91、检测样本的texas red通道ct值>38或无ct值,vic通道和fam通道ct值≤38,表明检测样本感染hpv18,感染hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82中的至少一种,未感染hpv16;
92、检测样本的texas red通道、vic通道和fam通道均为ct值≤38,表明检测样本感染hpv16,感染hpv18,感染hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82中的至少一种。
93、本发明对检测样本基因组dna的提取方法没有特殊限定,一般可用常规方法,或用核酸提取试剂盒提取检测样本的基因组dna。
94、更优选地,步骤s1中,提取所得到的检测样本的基因组dna,并使用相同的提取方法处理阳性质控品。
95、更优选地,步骤s2中,所述引物和探针的组合物存在于三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(ph8.3)中,即为引物探针混合液。
96、进一步优选地,步骤s2中,所述反应体系中,引物探针混合液、pcr buffer、pcr酶和模板的体积比为(9~11):(6.5~8.5):(2~4):(28~32),所述模板为检测样本的基因组dna、阴性质控品或使用相同的提取方法处理后的阳性质控品。
97、步骤s2中,所述反应体系中,引物探针混合液、pcr buffer、pcr酶和模板的体积比为10:7:3:30。
98、更优选地,步骤s2中,所述荧光定量pcr扩增的程序为:48~52℃,2分钟;93~97℃,15分钟;92~96℃,15秒,48~52℃,45秒,43~47个循环。
99、进一步优选地,步骤s2中,所述荧光定量pcr扩增的程序为:50℃,2分钟;95℃,15分钟;94℃,15秒,50℃,45秒,45个循环,收集荧光。
100、更优选地,步骤s2中,所述荧光定量pcr扩增的荧光通道选择texas red通道、vic通道、fam通道和cy5通道收集荧光。
101、与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
102、本发明克服了传统的宫颈癌筛查方法存在的检测耗时长、假阴性率高、操作技术门槛高的问题,提供了检测14种引发宫颈癌的hpv的引物和探针,并提供了相应的检测试剂盒,不仅简化操作过程,降低成本和技术复杂性,还大大缩短宫颈癌的筛查时间,具有高特异性,适用于临床上的大规模宫颈癌初步筛查,具有推广应用价值。