本发明微生物检验检测,具体涉及一种使用实时荧光定量pcr技术快速检测药品中大肠埃希菌的方法。
背景技术:
1、大肠埃希菌(escherichia coli,通常简称e. coli)是一种杆状的革兰氏阴性菌,一般存在于温血动物肠道后段。大部分大肠埃希菌对人类健康是有益的,是一种很常见的细菌,但是在一些特殊情况下会引起胃肠道和尿道感染,有一部分大肠埃希菌具有致病性,例如产肠毒素大肠埃希菌enterotoxigenic escherichiacoli (etec)、肠道出血性大肠埃希菌enterohemoclastic escherichia coli(ehec)、肠道侵袭性大肠埃希菌enteroinvasive escherichia coli (eiec) 。大肠埃希菌o157:h7/nm致病性最强,可以产生细菌毒素,可引起出血性结肠炎,严重者甚至死亡。药品微生物控制是药品质量保证的重要组成部分,药品污染微生物不仅直接影响药品的有效性,更有可能危及用药患者的生命安全;微生物污染还是评价药品质量和安全性的重要指标。《中国药典》2020年版四部通则“1107 非无菌产品微生物限度标准”中规定,口服给药、口腔黏膜给药制剂不得检出大肠埃希菌(1 g或1 ml)。中国药典规定的大肠埃希菌检查方法,需要进行增菌培养,选择和分离培养,全部过程需要3-6 d;此方法主要采用传统的生化反应和形态检查,虽然操作简单,但是步骤较多,时间长,对实验人员的经验要求较高,无法快速的得到检测结果,效率较低。
2、实时荧光定量pcr (real time fluorescence quantitative pcr,rt-pcr) 是近些年兴起的分子生物学技术,该技术已在医学检验、疾病分析、食品微生物检测及源性成分检测等研究等领域广泛应用,但是在药品控制菌检查中的应用却鲜见报道。本研究利用实时荧光定量pcr技术建立药品中大肠埃希菌的实时荧光定量pcr快速检测方法,为药品中控制菌的快速检测提供技术支持。
技术实现思路
1、本发明的目的是针对现有的问题,提供了一种使用实时荧光定量pcr技术快速检测药品中大肠埃希菌的方法。
2、本发明是通过以下技术方案实现的:
3、一种药品中大肠埃希菌成分检测用引物和探针
4、上游引物f:5’- ccatgcccttctccctttgt -3’;
5、下游引物r:5’- agctagggggtggaggattt -3’;
6、探针序列p:5’-(fam)cctgtcatcgacagcaacat -3’(mgb)。
7、(1)供试液的制备和增菌培养:
8、供试品溶液:取药品(液体制剂1 ml,固体制剂1 g)置于无菌锥形瓶中,加入灭菌tsb 100 ml;供试品阳性对照:上述供试品中加入不大于100 cfu的大肠埃希菌菌液;阳性对照:向100 ml tsb的无菌锥形瓶中加入不大于100 cfu的大肠埃希菌菌液;以稀释剂加入tsb培养基作为阴性对照。上述溶液分别置于36 ℃恒温培养箱中过夜培养18 h。
9、(2)细菌基因组的提取
10、取上述培养物1ml,按照商业化细菌基因组提取试剂盒的步骤提取细菌基因组。
11、(3)荧光pcr体系的构建
12、10 μl premix ex taqtm,大肠埃希菌上下游引物、taqman探针各1 μl(浓度为10 μm),提取dna模板1 μl,用灭菌水补足至总体积20 μl。
13、pcr反应程序:95 ℃预变性30 s;95 ℃ 15 s,59℃ 30 s,35个循环。
14、当fam荧光的ct值小于等于30时,说明供试品中检出大肠埃希菌,当fam荧光的ct值大于30时,说明供试品未检出大肠埃希菌。
15、本发明相比现有技术具有以下优点:
16、(1)本发明利用大肠埃希菌的保守基因malb设计特异性引物和探针,建立了快速检测药品中大肠埃希菌的实时荧光pcr技术,本方法灵敏度高,特异性强,耗时短,能够在第一时间得到药品的检测结果,并提出有效的改进措施。本发明从细菌的培养到细菌基因组的提取和pcr反应结束出结果,全程只需要1 d,比中国药典的方法节省了2-5 d;灵敏度高,基因组灵敏度可以达到10-3 ng;大肠埃希菌含量的灵敏度可达到1 cfu·g(ml)-1且灵敏度与药典方法完全一致。
17、(2)方法适应性试验中,对于不同细菌浓度的供试品阳性试验设置了药典方法进行方法适应性检查,供试品为没有抑菌成分的安神补脑液时,菌液稀释级为-9时,菌液浓度为1.1 cfu·ml-1,浓度较低,此浓度如果只做一个供试品阳性试验,有可能在供试品阳性组内没有细菌,故在此浓度下做四个供试品阳性平行试验,以保证供试品阳性组中有少量的细菌。此时供试品阳性组中菌液的含量为1 cfu,满足《中国药典》四部中控制菌检查方法适用性试验中对于试验菌的要求,药典方法和荧光pcr法都能检出试验菌,说明此药物对大肠埃希菌没有抑菌作用,可以按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查。药典方法和荧光pcr法的灵敏度一致,都为1 cfu·ml-1。
18、(3)使用需氧菌含量为3.3×102 cfu·g-1且大肠埃希菌为阴性的脉管康复胶囊时,供试品阳性组经过tsb过夜培养,仍能特异性的检出大肠埃希菌,说明本发明不受样品中其他微生物的干扰。菌液稀释级为-9时,菌液浓度为1.1 cfu·ml-1,浓度较低,当加入tsb培养基中的1 ml菌液很有可能并不含有细菌,导致四个-9稀释级中一个为阴性。药典方法和荧光pcr法的灵敏度一致,都为1cfu·g-1。
19、(4)中成药成分复杂且繁多,很有可能会有抑菌成分抑制细菌的生长。因此本发明对于有抑菌成分的抗菌消炎胶囊进行单独研究,在抗菌消炎胶囊的方法适用性试验中,结果与安神补脑液结果一致,说明此发明不受样品中抑菌成分的干扰,可以按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查。药典方法和荧光pcr法的灵敏度一致,都为1 cfu·g-1。
20、(5)实验器皿和样品中很有可能会存在死菌和dna片段,产生假阳性对试验产生干扰。部分学者采用叠氮溴化丙锭(pma)抑制死菌dna的扩增,当本发明采用40个循环时,部分阴性对照和供试品组会出现ct值为30-35的假阳性结果,将循环数减少至35时,所有的阴性对照和供试品均未出现阳性结果。本发明无需采用pma,既可以避免假阳性,又使操作更加简便,用时更短。
1.一种使用实时荧光定量pcr技术快速检测药品中大肠埃希菌的方法,其特征在于:
2.一种应用权利要求1所述的大肠埃希菌特异性基因检测用引物和探针进行药品中大肠埃希菌检测的方法,其特征在于包括以下步骤: