引物探针组合及试剂盒的制作方法

本发明涉及生物检测，特别涉及引物探针组合及试剂盒。

背景技术：

1、沙眼衣原体是革兰氏阴性专性细胞内的细菌，人类是沙眼衣原体的唯一自然宿主。不同衣原体血清型会导致不同的疾病，血清型a～c会导致可预防性失明，血清型d～k是世界范围内最常见的性传播疾病的细菌，血清型l1～l3会导致淋巴系统感染。沙眼衣原体有一个显著特征，女性生殖道感染是无症状的，如果不及时进行治疗，多达50％的受感染女性会持续感染，导致输卵管破坏，这也是导致不孕的主要原因。女性上生殖道感染还会导致盆腔炎和子宫内膜炎。现在沙眼衣原体目前仍然没有有效的疫苗。通常由沙眼衣原体引起的感染，在早期是可以治疗的，因此，及时和准确的诊断对疾病的治疗和防止疾病传播具有重要意义。

2、沙眼衣原体感染可通过抗原抗体检测，血清学检测和核酸扩增试验(naats)进行诊断。通过抗体这种间接检测方法，检测效率较低。血清学检测不适用于急性反应，通常需要数周甚至数月时间，检测结果准确性低。尽管出现了基于核酸检测技术的非pcr方法，但是pcr仍然是核酸检测的金标准。naats是目前首选的诊断方法，具有较高的特异性和敏感性。

3、目前国内已有基于实时荧光定量pcr技术检测ct-dna的试剂盒应用于临床检测中，都采用隐蔽性质粒单靶标的检测技术，2006年瑞典报道了一种沙眼衣原体突变体，这种突变体的隐蔽性质粒存在377bp的缺失。2016年马来西亚一项研究报道，92例沙眼衣原体患者中，有6例是无隐蔽性质粒的沙眼衣原体突变体。这些试剂盒可能会导致漏检，因此发明一种可靠的引物探针组合及试剂盒具有现实意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供引物探针组合及试剂盒，其灵敏度高、特异性强、操作简单、不漏检。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了引物组，包括引物组合1和/或引物组合2；

4、所述引物组合1包括引物1和引物2；

5、所述引物1具有：

6、(1)、如seq id no:1所示的核苷酸序列；或

7、(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或

8、(3)、与如(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

9、所述引物2具有：

10、(4)、如seq id no:2所示的核苷酸序列；或

11、(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(4)的相同或相似；或

12、(6)、与如(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

13、所述引物组合2包括引物3和引物4；

14、所述引物3具有：

15、(7)、如seq id no:4所示的核苷酸序列；或

16、(8)、如(7)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(7)的相同或相似；或

17、(9)、与如(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

18、所述引物4具有：

19、(10)、如seq id no:5所示的核苷酸序列；或

20、(11)、如(10)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(10)的相同或相似；或

21、(12)、与如(10)或(11)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

22、所述多个为2个至7个。

23、本发明还提供了引物探针组，包括探针和上述引物组；

24、所述探针包括探针1和/或探针2；

25、所述探针1具有：

26、(13)、如seq id no:3所示的核苷酸序列；或

27、(14)、如(13)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(13)的相同或相似；或

28、(15)、与如(13)或(14)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

29、所述探针2具有：

30、(16)、如seq id no:6所示的核苷酸序列；或

31、(17)、如(16)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(16)的相同或相似；或

32、(18)、与如(16)或(17)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

33、所述多个为2个至7个。

34、在本发明的一些具体实施方案中，上述引物探针组中的所述探针1、所述探针2的5’端标记报告荧光基团fam、3’端标记不发光的淬灭基团标记bhq1。

35、在本发明的一些具体实施方案中，上述引物探针组还包括引物5、引物6和探针3；

36、所述引物5具有：

37、(19)、如seq id no:7所示的核苷酸序列；或

38、(20)、如(19)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(19)的相同或相似；或

39、(21)、与如(19)或(20)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

40、所述引物6具有：

41、(22)、如seq id no:8所示的核苷酸序列；或

42、(23)、如(22)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(22)的相同或相似；或

43、(24)、与如(22)或(23)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

44、所述探针3具有：

45、(25)、如seq id no:9所示的核苷酸序列；或

46、(26)、如(25)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(25)的相同或相似；或

47、(27)、与如(25)或(26)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

48、所述多个为2个至7个。

49、在本发明的一些具体实施方案中，上述引物探针组中的所述探针3的5’端标记报告荧光基团cy5、3’端标记不发光的淬灭基团标记bhq2。

50、本发明还提供了上述引物组或上述引物探针组在如下方面中的应用：

51、(i)、检测沙眼衣原体；和/或

52、(ii)、制备检测沙眼衣原体的试剂、试剂盒或装置。

53、本发明还提供了试剂，包括上述引物组或上述引物探针组，以及可接受的辅料或助剂。

54、本发明还提供了试剂盒，包括上述引物组或上述引物探针组，以及可接受的辅料或助剂。

55、在本发明的一些具体实施方案中，上述试剂盒包括pcr反应液1和pcr反应液2；

56、所述pcr反应液1包括：

57、(a)、上述引物组；或

58、(b)、上述引物探针组；和

59、(c)、双功能dna聚合酶；和

60、(d)、尿嘧啶dna糖基化酶；和

61、(e)、dntp；和

62、(f)、pcr扩增增强剂；

63、所述pcr反应液2包括锰离子。

64、在本发明的一些具体实施方案中，上述试剂盒的所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述探针1和所述探针2的浓度各自为0.1μmol/l～1.0μmol/l；

65、所述反应中所述引物5、所述引物6或所述探针3的浓度各自为0.1μmol/l～0.5μmol/l。

66、本发明还提供了装置，包括可接受的部件，以及包被有：

67、(a)、如权利要求1所述的引物组；或

68、(b)、如权利要求2或3所述的引物探针组；或

69、(c)、如权利要求5所述的试剂。

70、本发明还提供了沙眼衣原体的检测方法，包括取上述引物组或上述引物探针组，与扩增试剂和待测核酸样品混合，反应，获得检测结果。

71、在本发明的一些具体实施方案中，上述检测方法中，所述反应中的所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述探针1和所述探针2的浓度各自为0.1μmol/l～1.0μmol/l；

72、所述反应中所述引物5、所述引物6或所述探针3的浓度各自为0.1μmol/l～0.5μmol/l。

73、本发明的引物组和试剂盒有如下效果：

74、1.本发明可检测男性尿道拭子、女性宫颈拭子和尿液样本。

75、2.本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可达到25ifu/ml，说明其灵敏度好。

76、3.本发明提供的引物和探针对不含隐蔽性质粒的沙眼衣原体有检测信号，说明特异性好。

77、4.本发明提供的以引物探针组合物作为主要成分的用于沙眼衣原体核酸检测的试剂盒，操作方便，对沙眼衣原体有很强的特异性特异性好，检测方法耗时较少，对未知样本中的沙眼衣原体核酸进行准确的检测，为诊断沙眼衣原体感染提供可靠的实验依据。