一种基于外泌体递送microRNA制备诱导性多能干细胞的方法与流程

本发明属于生物，尤其是涉及一种基于外泌体递送microrna制备诱导性多能干细胞的方法。

背景技术：

1、诱导性多能干细胞（ipscs）技术是通过向终末分化细胞导入特定的转录因子，通过特定基因的表达将体细胞逆转为多能干细胞，使其具备类似于胚胎干细胞的全能性及无限增殖特性。

2、 ipscs技术开发早期多采用整合病毒载体介导来实现上述细胞逆转过程。最初使用“逆转录酶病毒”为载体向体细胞中植入几种转录因子基因，通过这些转录因子表达对细胞实现基因重编程，最终获得ips细胞。而这种方法的缺陷是增加了宿主细胞基因组不稳定性风险，有可能会由于外源基因插入细胞基因组，而干扰了内源基因的表达，从而诱发癌症。

3、随着ips技术不断发展，以及人们对其衍生的细胞产品用于药物开发及临床应用的迫切期望，科学家们正在积极的通过不同策略开发安全性更高的ipscs诱导技术，以达到有效治疗应用的安全性和产品质量标准要求。

4、目前mirna法被认为是未来临床应用最有希望的技术策略，其不涉及基因编辑等过程，无基因整合风险，但仍然存在一些尚未解决的问题：（1）单独使用诱导效率不高，通常与转录因子导入联用以提高诱导效率；（2）microrna导入细胞的方式是通过脂质体，导入效率相对较低；（3）脂质体的使用导致外源物质引入，同时其本身也存在一定细胞毒性，会参与细胞生理活动，进而有可能影响后续细胞质量。（4）为降低脂质体对细胞造成的毒性，转染后需在4-8小时内换液，此步骤增加了操作的繁琐性。因此提升此方法优化microrna组分及递送方式仍为提高诱导效率的攻坚难点。

5、目前mirna介导的ips诱导技术主要以脂质体转载，从未有文献报道过使用外泌体来实现此过程。

6、外泌体(exosomes)是一种直径在30-150nm之间的茶托型结构的小囊泡，包含rna、蛋白质、microrna、dna片段等多种成分。外泌体的结构（磷脂双分子层和囊泡状结构）和生理特性，使它们具有很好的生物相容性，低免疫原性和低毒性使其可以很容易的被任何器官和组织中的细胞摄取，且不会引起机体的免疫反应，具有无毒、生物相容性好，是mirna递送系统的理想候选者。目前对外泌体递送系统研究，主要集中于药物递送，即提取细胞本身自装载的外泌体进行靶向细胞治疗；或者外泌体提取后进行药物装载用于后续靶向细胞治疗。在ips细胞制备过程中尚未有人尝试。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种基于外泌体递送microrna制备诱导性多能干细胞的方法。

2、为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

3、本发明的第一方面，提供了一种基于外泌体递送microrna制备诱导性多能干细胞的方法，该方法包括如下步骤：

4、s1：将目标microrna装载于外泌体中；

5、s2：将装载有目标microrna的外泌体添加至含有被转染的细胞的培养基中进行培养使其转染至细胞内；

6、s3：将步骤s2获得的发生形变的克隆细胞团进行克隆挑取，传代培养，获得诱导性多能干细胞。

7、在本发明的一些实施例中，步骤s1中的装载方法为电穿孔、超声或直接孵育。

8、在本发明的一些实施例中，步骤s1中的外泌体来自人源细胞或牛奶外泌体。

9、在本发明的一些实施例中，所述人源细胞的类型与被转染细胞的类型相同。

10、在本发明的一些实施例中，人源细胞为外周血单个核细胞、间充质干细胞、成纤维细胞或内皮祖细胞。

11、在本发明的一些实施例中，步骤s1中的外泌体的制备方法包括如下步骤：

12、a：将细胞接种于培养瓶中，加入完全培养基，培养至融合度约50-60%，更换为dmem培养基，继续培养2天后，收集培养上清离心后置于-80℃温度下待用；

13、b：将细胞上清溶解离心，收集上清后离心，收集沉淀用pbs重悬后，再次离心，沉淀用pbs重悬待用。

14、在本发明的一些实施例中，步骤s1中将目标microrna通过电穿孔装载于外泌体中的具体步骤为：

15、将mirna悬液与外泌体悬液等体积混合，置于电转仪中进行电转，操作结束后将外泌体37℃静置，加入pbs，离心，沉淀用pbs重悬待用。

16、在本发明的一些实施例中，步骤s1中将目标microrna通过超声装载于外泌体中的具体步骤为：

17、将mirna悬液与外泌体悬液等体积混合均匀，使用超声波细胞破碎仪将超声探头没入混合液内，超声分 6 个周期，超声波细胞破碎仪参数设置为：频率20 khz，振幅20%，30s on/30 s off，整个过程在冰浴上进行，超声结束后，将所获得的溶液在 37℃恢复 30min，将所获得的溶液重新使用 pbs 离心洗涤，收集外泌体。

18、在本发明的一些实施例中，步骤s1中将目标microrna通过直接孵育装载于外泌体中的具体步骤为：

19、将mirna悬液与外泌体悬液等体积混合均匀，在恒温摇床上，37°c 孵育 1h收集外泌体。

20、在本发明的一些实施例中，所述步骤s2中每隔3-6天转染1次，连续转染三次以上。

21、在本发明的一些实施例中，目标microrna包括mir-195-5p、mir-211-5p、mir-520c-3p、mir-30e-5p、mir-519d-3p、mir-32-5p中的至少一种。

22、在本发明的一些实施例中，目标microrna的使用终浓度总和不超过200nm。

23、在本发明的一些实施例中，步骤s1中外泌体的浓度为0.5×1012-1×1012颗粒/ml。

24、在本发明的一些实施例中，步骤s1中目标microrna与外泌体等体积混合。

25、本发明还提供一种诱导性多能干细胞的制备方法，包括：

26、装载microrna的外泌体与病毒重编程方法联合使用，所述装载microrna的外泌体在病毒转染之前或之后加入培养液中；

27、或所述装载microrna的外泌体与质粒法联合使用，所述装载microrna的外泌体在质粒转染之前或之后加入培养液中；

28、或所述装载microrna的外泌体与化学小分子法联合使用，所述装载microrna的外泌体在加入化学小分子物质之前或之后加入培养液中。

29、在本发明的一些实施例中，当装载microrna的外泌体与病毒重编程方法联合使用时，所述装载microrna的外泌体在病毒转染之后48h加入培养液中；

30、当装载microrna的外泌体与质粒法联合使用，所述装载microrna的外泌体在质粒转染之后48h加入培养液中；

31、当装载microrna的外泌体与化学小分子法联合使用，所述装载microrna的外泌体在加入化学小分子物质之后48h加入培养液中。

32、其中，病毒重编程方法是指将一定浓度的表达转录因子（例如oct4、sox2、klf4、myc）的病毒（例如仙台病毒、腺病毒等）添加于培养细胞中感染靶细胞，孵育过夜并更换新鲜培养基，持续培养每天换液直至第七天左右，将细胞消化接种于包被matrigel的培养皿中继续培养直至有有ips细胞克隆形成。

33、质粒法是指将包含转录因子（例如oct4、sox2、klf4、c-myc）序列的质粒载体与电转缓冲液混合后重悬细胞进行电转。将电转后的细胞接种于预先包被了matrigel的培养皿中，每天更换新鲜培养基，直至有克隆形成。

34、化学小分子法是指向培养细胞中持续添加一定浓度的化学小分子物质（例如chir99021、pd0325901、sb590885、iwp2和y27632等），持续培养、换液直至有ips细胞克隆出现。

35、相比于现有技术传统递送系统脂质纳米颗粒（lnps），外泌体具有以下优点：

36、外泌体在体液中比lnps更稳定，lnps可以容易被巨噬细胞或网状内皮细胞清除；由于其内源性和高生物相容性，外泌体具有相对较低的细胞毒性和免疫原性，使用后不需及时去除；外泌体具有更高的细胞摄取率，增加mirna的转导效率；外泌体在运输过程中可以提供更好的保护，因为包裹在双层外质体膜内，不易降解。

37、相对于现有技术，本发明具有以下优势：

38、（1）本发明的方法操作过程简单，递送过程不引入外源物质，便于质控。

39、（2）本发明的方法使用外泌体递送mirna，通过细胞自然内吞导入细胞内部，对细胞不产生任何损伤及毒性，明显提高mirna转染效率。

40、（3）本发明的方法与现有mirna诱导技术相比最终ipsc诱导率较脂质体方式明显增高。