工程化的γδT细胞的制作方法

背景技术：

1、t淋巴细胞的抗原识别可通过高度多样性的异二聚体受体，t细胞受体(tcr)来实现。血液和淋巴器官中大约95％的人t细胞表达异二聚体αβ tcr受体(αβ t细胞谱系)。血液和淋巴器官中大约5％的人t细胞表达异二聚体γδ tcr受体(γδ t细胞谱系)。这些t细胞亚群可分别称为“αβ”和“γδ”t细胞。αβ和γδ t细胞的功能不同。αβ t细胞驱动mhc限制性过继免疫并且γδ t细胞桥接先天和非mhc限制性过继免疫。当抗原呈递细胞(apc)在i/ii类mhc的背景下呈递抗原时，随后发生αβ t细胞的活化。树突状细胞是天然t细胞的已知最强的活化剂。两种信号对于完全αβ t细胞活化是必要的：a)由mhc-肽与tcr-cd3复合物的相互作用产生的信号；和b)由t细胞上的cd28和apc上的b7家族的成员的相互作用产生的信号(共刺激信号)。与αβ t细胞相比，γδ t细胞能够直接识别抗原，并且不需要mhc-肽与tcr-cd3复合物的相互作用。因此，据称γδ t细胞不是mhc限制性的。在内源性t细胞中，缺乏共刺激信号导致克隆无反应性。

2、内源性γδ t细胞直接识别抗原的能力使γδ t细胞成为有吸引力的治疗工具。然而，操纵和引导内源性γδ t细胞的困难限制临床上患者源性的γδ t细胞的治疗有用性。

技术实现思路

1、在一些实施方案中，本公开提供一种工程化的γδ t细胞，其中所述工程化的γδt细胞被工程化以表达一个、两个或更多个不同的肿瘤识别部分，其中每个肿瘤识别部分识别肿瘤抗原。肿瘤识别部分可被设计成识别相同肿瘤抗原的不同表位、不同肿瘤的抗原、肿瘤抗原和活化或失活共刺激/免疫调节受体、与mhc分子复合的抗原、或归巢受体。在一些情况下，本公开提供一种使用工程化的γδ t细胞治疗癌症的方法。工程化的γδ t细胞可被设计为与受试者同种异体，并且工程化的γδ t细胞可以是肿瘤特异性同种异体γδ t细胞。在一些情况下，工程化的γδ t细胞缺乏人hla基因座。hla基因座可选自由以下组成的组：hla-a、hla-b、hla-c、hla-dp、hla-dm、hla-doa、hla-dob、hla-dq和hla-dr，并且工程化的γδ t细胞可被设计成缺乏来自两种或更多种hla基因座的基因表达。在一些情况下，至少一个工程化的肿瘤识别部分是工程化的t细胞受体。t细胞受体可以是人t细胞受体、小鼠t细胞受体、大鼠t细胞受体或嵌合t细胞受体。工程化的t细胞受体可以是工程化的αβtcr，并且两种不同的工程化的αβ tcr可被设计成识别相同抗原的不同表位。在其他情况下，工程化的t细胞受体是工程化的γδ tcr。在一些实施方案中，工程化的γδ t细胞被设计成浸润实体肿瘤。工程化的γδ t细胞可被设计成识别在肿瘤细胞内细胞内或细胞外表达的肿瘤抗原。在细胞外表达的肿瘤抗原的情况下，工程化的γδ t细胞可被构造成识别为与mhc分子复合的肽的抗原。在一些情况下，肿瘤抗原是淋巴瘤抗原、白血病抗原、多发性骨髓瘤抗原、乳腺癌抗原、前列腺癌抗原、膀胱癌抗原、结肠和直肠癌抗原、脑癌抗原、胃癌抗原、头颈癌抗原、肾癌抗原、肺癌抗原、胰腺癌抗原、肉瘤抗原、间皮瘤抗原、卵巢癌抗原或黑素瘤抗原。在一些情况下，工程化的γδt细胞源自vδ1+t细胞、vδ2+t细胞或vδ3+t细胞、或vδ1+、vδ2+或vδ3+t细胞的混合物。工程化的γδ t细胞可源自cd3+t细胞或cd3-t细胞。工程化的γδt细胞可被设计成识别相同抗原的不同表位。

2、在一些情况下，两个或更多个不同的肿瘤识别部分由不同的多核苷酸序列编码，并且每个不同的多核苷酸序列被工程化以识别相同抗原的不同表位。在一些情况下，从肿瘤细胞克隆至少一个肿瘤识别部分。在其他情况下，至少一个肿瘤识别部分是合成工程化的。在一些情况下，至少一个肿瘤识别部分是识别肿瘤抗原的抗体片段或其抗原结合片段。肿瘤识别部分可以是工程化的免疫球蛋白轻链、工程化的免疫球蛋白重链或其任何片段。在一些情况下，工程化的γδ t细胞还表达迁移和归巢受体。归巢分子可将工程化的γδ t细胞粘附至实体肿瘤。在一些情况下，工程化的γδ t细胞被进一步工程化以缺乏至少一种免疫检查点基因，并且所述免疫检查点基因可以是ctla-4基因、pd-1基因、lag3基因、ceacam-1基因或另一种基因。在一些情况下，肿瘤抗原选自cd19、cd30、cd22、cd37、cd38、cd56、cd33、cd30、cd138、cd123、cd79b、cd70、cd75、ca6、gd2、甲胎蛋白(afp)、癌胚抗原(cea)、ceacam5、ca-125、muc-16、5t4、napi2b、ror1、ror2、5t4、plif、her2/neu、egfrviii、gpmnb、liv-1、糖脂f77、成纤维细胞活化蛋白、psma、steap-1、steap-2、间皮素、c-met、cspg4、结合素-4、vegfr2、psca、叶酸盐结合蛋白/受体、slc44a4、cripto、ctag1b、axl、il-13r、il-3r、sltrk6、gp100、mart1、酪氨酸酶、ssx2、ssx4、nyeso-1、上皮肿瘤抗原(eta)、magea家族基因(如mage3a.mage4a)、kklc1、突变ras、βraf、p53、mhc i类链相关分子a(mica)、mhc i类链相关分子b(micb)、hpv或cmv。在其他情况下，至少一个肿瘤识别部分是被设计成识别本文所述的抗原、部分或任何抗原的片段的嵌合抗原受体(car)。

3、在其他实施方案中，工程化的γδ t细胞被工程化以表达抗原识别部分，其中所述抗原识别部分识别与自身免疫性疾病相关的抗原。此类细胞可被工程化以表达一个、两个或更多个抗原识别部分，其中每个抗原识别部分识别相同自身免疫抗原的不同表位。在一些情况下，肿瘤识别部分识别不同的抗原、抗原和活化或失活共刺激/免疫调节受体、与mhc分子复合的抗原、或与自身免疫性疾病相关的归巢受体。

4、在替代实施方案中，工程化的γδ t细胞被工程化以表达抗原识别部分，其中所述抗原识别部分识别致病性抗原。此类细胞可被工程化以表达两个或更多个抗原识别部分，其中每个抗原识别部分识别相同致病性抗原的不同表位。在一些情况下，肿瘤识别部分识别不同的抗原、抗原和活化或失活共刺激/免疫调节受体、与mhc分子复合的抗原、或与致病性抗原相关的归巢受体。

5、致病性抗原可以是细菌分子或病毒分子，如细菌蛋白或病毒蛋白。

6、在其他情况下，本公开提供一种γδ t细胞群体，其中所述γδ t细胞群体的扩增用刺激γδ t细胞群体以在少于24小时内约1次细胞分裂的平均速率扩增的试剂活化。在一些情况下，扩增的γδ t细胞群体包含一定百分比的δ1 t细胞、δ2 t细胞或δ3 t细胞，并且前述扩增的γδ t细胞中的任一种的百分比可以大于5％。在一些情况下，γδ t细胞群体中所述百分比的δ1、δ2或δ3 t细胞在体外或体内以在少于24小时内约1次细胞分裂的平均速率扩增。在一些情况下，γδ t细胞群体还包含一定量的工程化的γδ t细胞，其中所述工程化的γδ t细胞被工程化以表达抗原识别部分。工程化的γδ t细胞可被设计成也缺乏人hla基因座。刺激γδ t细胞群体扩增的试剂可以是抗体，并且所述抗体可选自由以下组成的组：5a6.e9、b1、ts8.2、15d、b6、b3、ts-1、γ3.20、7a5、immu510、r9.12和11f2抗体。在一些情况下，抗体被固定在表面上。

7、在一些情况下，本公开涉及γδ t细胞的活化表位。在一些情况下，所述活化表位刺激γδ t细胞群体以在少于24小时或支持γδ t细胞群体的快速扩增的另一合适的时间段内1次细胞分裂的平均速率扩增。在一些情况下，活化表位是δ tcr(如δ1、δ2或δ3 tcr)的氨基酸序列。在一些情况下，活化表位是由选自由以下组成的组的抗体中的任一种结合的表位：5a6.e9、b1、ts8.2、15d、b6、b3、ts-1、γ3.20、7a5、immu510、r9.12和11f2抗体。活化表位可包含来自vδ1基因区段和jδ1、jδ2、jδ3或jδ4基因区段的氨基序列。在一些情况下，活化表位是构象表位，并且在其他情况下，活化表位是线性表位。

8、在一些情况下，本公开提供一种确定γδ t细胞受体的表位的方法，所述方法包括(a)从所述γδ t细胞受体制备表位文库；(b)使所述表位文库与抗体接触；以及(c)鉴别所述表位文库中由所述抗体结合的至少一个表位的氨基酸序列。抗体可选自由以下组成的组：5a6.e9、b1、ts8.2、15d、b6、b3、ts-1、γ3.20、7a5、immu510、r9.12、11f2抗体。在一些情况下，抗体被连接至固体载体上。t细胞受体的表位可对应于t细胞受体中的连续或不连续的氨基酸序列。表位文库可包括长度在约10个氨基酸至约30个氨基酸、长度在约10个氨基酸至约20个氨基酸、长度在约5个氨基酸至约12个氨基酸范围内的片段。在一些情况下，抗体被标记。标记可以是放射性分子、发光分子、荧光分子、酶或生物素。在一些情况下，表位文库包括从合成设计的cdna翻译的肽，其中所述合成设计的cdna包含多种合成设计的γtcr和多种合成设计的δ tcr的区段。在其他情况下，表位文库包括从自来源于人pbmcs或从人恶性或正常上皮组织分离的淋巴细胞的人δγ t细胞提取的总rna扩增的肽。合成设计的cdna文库可包括多个vδ1、vδ2和vδ3基因区段，在其jδ区域不同，并且所述文库可包括多个vγ2、vγ3、vγ4、vγ5、vγ8、vγ9、vγ10、δ1、δ2和δ3基因区段。

9、在一些实施方案中，本公开提供一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的工程化的γδ t细胞。本公开的另外方面和优点对于本领域的技术人员将从以下详细描述变得显而易见，其中仅示出和描述本公开的说明性实施方案。如将认识到，本公开能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够进行修改，所有修改都不脱离本公开内容。因此，附图和描述应被视为在本质上是说明性的而不是限制性的。

10、以引用的方式并入

11、本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都以引用的方式并入本文，所述引用的程度就如同已特定地和个别地指示将各个别出版物、专利或专利申请以引用的方式并入一般。