培养鼻黏膜基底层上皮干细胞的方法与流程

本发明涉及一种培养鼻黏膜基底层上皮干细胞的方法，属于干细胞培养。

背景技术：

1、呼吸道(respiratorytract)是人体直接对外界开放的器官之一，鼻腔气道上皮细胞作为呼吸道的门户是人体一道重要的生理防御屏障，在抵御病原微生物入侵及清除有毒物质等方面起着重要的作用。气道和呼吸肺泡源自原始内胚层的不同原基(buds)，即气管原基和肺原基，两个原基中含有不同的干细胞，分别称为近端(proximal)和远端(distal)干细胞。近端干细胞即是气道基底干细胞(basal stem cells)，远端干细胞包括细支气管基底干细胞(basal stem cells)、呼吸性细支气管与肺泡导管连接处(badj)的干细胞(bronchioalveolar stem cells，bascs)以及肺泡ⅱ型细胞。目前研究的共识是，沿着气道至肺分布着不同干细胞，他们具有区域性(region specific)，例如近端的气道干细胞不能分化成远端肺部的细胞，反之亦然，远端的干细胞也不能分化为气道细胞。

2、现有研究表明，上呼吸道鼻腔黏膜基底层上皮干细胞和下呼吸道支气管基底层干细胞所形成的克隆不但形态相同，而且基因表达谱有99.0％的重叠。这些研究包括从动物模型到临床研究，已经证明从下呼吸道气管基底层来源的上皮干细胞(p63和krt5阳性)可以参与肺损伤后的修复及再生。例如：2015年哈佛大学frank mckeon教授课题组证实h1n1流感病毒感染所致小鼠肺损伤动物模型中，气管基底层上皮干细胞应激快速扩增，迁移致肺损伤部位并分化成肺泡细胞；2018年同济大学左为教授团队开展了人自体支气管基底层干细胞移植治疗支气管扩张的临床研究中，两例病人的数据表明移植后3至6个月，干细胞形成了新的肺泡和支气管结构，进而替代并修复了损伤的肺组织。因此，分离自鼻黏膜组织的鼻黏膜基底层上皮干细胞(hnepcs)有着良好的应用前景。然而，目前并未有较好的培养鼻黏膜基底层上皮干细胞的方法。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明提供了一种培养鼻黏膜基底层上皮干细胞的方法，采用鼻刷刮取的方式获取，方便快捷，培养成本低，且培养所得干细胞的纯度较高。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种培养鼻黏膜基底层上皮干细胞的方法，采用鼻刷刮取的方式，从鼻腔黏膜深处获取细胞，进行传代培养及干性验证；在鼻腔黏膜基底层上皮干细胞的融合度达到80％～90％时，对鼻腔黏膜基底层上皮干细胞进行传代或冻存。

4、进一步地，从鼻腔黏膜深处获取细胞，进行传代培养的具体操作为：

5、(1)刷取鼻腔黏膜基底层上皮干细胞之前，用100μl的ln 521(浓度5μg/ml)铺24孔板；

6、(2)用生理盐水清洗鼻子3次；

7、(3)鼻拭子伸入鼻甲区，旋转、前后刷取鼻腔黏膜基底层上皮干细胞；

8、(4)折断鼻拭子放入装有3ml的imdm(不含fbs，含2.5×amphotericin b，pen/strep和庆大霉素20μg/ml)培养基的15ml离心管中；

9、(5)涡旋剧烈摇晃30次；

10、(6)用镊子取出拭子在管壁挤出多余液体，弃鼻拭子，1000rpm离心5min；

11、(7)弃上清，用0.5ml的trypletmselect酶消化2min，0.5ml的imdm培养基(含10％fbs)终止，枪上下吹打10次，收集滤液；

12、(8)用dpbs(含2.5×amphotericin b,pen/strep和庆大霉素20μg/ml)洗1次，1000rpm离心5min，弃上清；

13、(9)将样本种到提前用ln 521铺板的孔板中，用pneumaculttm-ex plus medium培养基(含2.5×amphotericin b，pen/strep和庆大霉素20μg/ml)；

14、(10)放入37℃培养箱中培养。

15、进一步地，进行干性验证的具体操作为：

16、(1)细胞培养：使用pneumaculttm-ex plus medium培养基培养细胞，每两天换一次液，传代扩增培养，传至p2代时将细胞种于cell slip中，细胞贴壁后进行细胞免疫荧光实验；

17、(2)从培养箱中拿出细胞，用pbs洗3次，每次5min；

18、(3)使用5ml 4％多聚甲醛固定15min；

19、(4)弃去4％多聚甲醛，加5ml 0.5％triton x-100，通透15min；

20、(5)弃去0.5％triton x-100，加5ml 5％山羊血清封闭液，封闭30min；

21、(6)弃去封闭液，滴加一抗，保湿盒中4℃过夜孵育；

22、所述一抗，包括sox2抗体和sox9抗体；

23、sox2抗体，反应种属：mouse，rat，human，宿主：rabbit，使用浓度1:1000；

24、sox9抗体，反应种属：mouse，rat，human，宿主：rabbit，使用浓度1:240；

25、(7)吸弃一抗，dpbs洗3次，每次5min；

26、(8)滴加二抗，避光，37℃，孵育1h；

27、所述二抗，包括alexa fluor 488和alexa fluor 594；

28、alexa fluor 488，反应种属：mouse，宿主：goat，使用浓度1:500；

29、alexa fluor 594，反应种属：rabbit，宿主goat，使用浓度1:500；

30、(9)弃去二抗，dpbs洗3次，每次5min；

31、(10)滴加抗淬灭封片剂并用盖玻片封片；

32、(11)荧光显微镜下观察并拍照。

33、进一步地，进行传代的具体操作为：

34、(1)采用紫外光对生物安全柜提前照射30min，并将pneumaculttm-ex plus medium培养基，dpbs和trypletmselect酶，提前从4℃冰箱拿出恢复至室温；

35、(2)吸出t 75培养瓶中的培养基，使用4ml的dpbs将其清洗两次；

36、(3)吸出dpbs，并向培养瓶中加入3ml的trypletmselect酶；

37、(4)旋紧培养瓶的瓶盖，摇晃培养瓶，并用掌心拍打瓶身，待trypletmselect酶反应6min；

38、(5)向培养瓶中加入3ml的dpbs终止反应，并进行轻柔吹打混合，然后吸取细胞悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

39、(6)使用2ml的pneumaculttm-ex plus medium培养基重悬沉淀，并进行细胞计数。然后吸取细胞悬液分别传至2个t 75培养瓶中，完成细胞传代。

40、进一步地，进行冻存的具体操作为：

41、(1)采用紫外光对生物安全柜提前照射30min，并将pneumaculttm-ex plus medium培养基，dpbs，trypletmselect酶和ctstmsynth-a-freezetm冻存液，提前从4℃冰箱拿出恢复至室温；

42、(2)吸出t 75培养瓶中的培养基，使用4ml dpbs将其清洗两次；

43、(3)吸出dpbs，并向培养瓶中加入3ml trypletmselect酶；

44、(4)旋紧培养瓶的瓶盖，摇晃培养瓶，并用掌心拍打瓶身，待trypletmselect酶反应6min；

45、(5)向培养瓶中加入3ml dpbs终止反应，并进行轻柔吹打混合，然后吸取细胞悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

46、(6)弃上清，加入1ml ctstmsynth-a-freezetm冻存液，在吹打混合后，采用移液枪取细胞悬液于冻存管，拧紧瓶盖，然后用封口膜封口，并立即放入程序降温盒中，保存温度为-80℃，在程序降温盒中保存一夜后，次日将其放入液氮罐中保存。

47、利用该鼻刷刮取鼻腔黏膜基底层上皮干细胞的培养方法，能够通过相对简单且方便的方法培养鼻腔黏膜基底层上皮干细胞，便于熟练掌握细胞培养的整体流程、复苏、换液、传代及冻存操作。此外，本发明对鼻腔黏膜基底层上皮干细胞的培养方法进行优化，采用该方法来培养鼻腔黏膜基底层上皮干细胞的培养成本低，培养操作流程简单可靠。