一种天然水体中胞内外DNA精准提取分离的方法

本发明涉及一种天然水体中胞内外dna精准提取的方法，属于生物领域中的dna提取技术。

背景技术：

1、eps中的一大类别——透明胞外聚合物颗粒(transparent exopolymerparticles，tep)是连接颗粒有机碳(particulate organic carbon，poc)与溶解有机碳(dissolved organic carbon，doc)两大有机碳库的纽带。tep是dom转化为pom的重要途径对碳循环有重要意义。tep由酸性多糖组成，其他成分还包括蛋白质、腐殖酸、氨基酸和金属等。tep在光学显微镜下不可见，但属于可以用阿尔新蓝对其染色后进行观察的一种eps。

2、透明胞外聚合物颗粒(tep)在水环境中普遍存在。tep具有低密度的特性，能延长水体中固体颗粒物的停留时间，继而影响水体中的碳循环，影响着吸附在聚集体上的活性元素，进一步影响水体中的营养元素循环。透明颗粒物在水生态系统中利用自身的高黏性形成大型凝聚体(如“湖雪”、“海雪”)，促使物质的沉降或水平迁移，同时透明胞外聚合物颗粒可以为微生物提供栖息地，从而影响细菌的组成和分布，以及水体中的营养盐循环。

3、环境dna是指从环境样本如土壤、沉积物、空气、水体等所提取到的dna。它是来自微生物、动物、植物等多个不同物种的混合dna，既包含了从生物体脱落或释放到环境中活细胞的胞内dna(intracellular dna,idna)，也包括由于生物体死亡后的腐烂尸体所裂解和细胞破损释放到环境中的胞外dna(extracellular dna，edna)。近年来，随着环境dna技术的逐渐成熟和发展，环境dna还被用于水生生物量的动物的食性分析、种群大小和种群动态、抗性基因、功能基因等方面的研究。

4、目前分离水体中胞内外dna的方法大多数为使用0.22μm滤膜过滤，将细胞内含有的胞内dna截留在滤膜上，游离的胞外dna过滤到滤液中。但研究发现透明胞外聚合物颗粒中也含有大量的胞外dna。同时，研究人员通过实验得出，透明胞外聚合物颗粒中胞外dna含量远高于胞内dna含量。透明胞外聚合物颗粒粒径大于0.22μm，采用0.22μm滤膜过滤的方式会将透明胞外聚合物颗粒截留在滤膜上，从而将其中的胞外dna归类于胞内dna，因此，现有的过0.22μm滤膜分离胞内外dna方法，会低估胞外dna的含量，高估胞内dna含量。

5、因此，亟需一种能够破坏透明胞外聚合物颗粒但不破坏生物膜和dna的提取剂，从而将透明胞外聚合物颗粒中含有的胞内外dna释放出来，提供一种精准提取天然水体中的胞内外dna的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决传统dna提取方法低估胞外dna含量的问题，并提供一种天然水体中胞内外dna精准提取的方法。该方法可以使海水、淡水中的透明胞外聚合物颗粒均匀分散，从而将其中的胞内外dna释放出来，再通过0.22μm滤膜过滤，将胞外dna收集到滤液中，胞内dna留在滤膜上，在滤液中提取出胞外dna，在滤膜上提取胞内dna，可以有针对性的、精准的对水体中胞内外dna进行提取。

2、本发明所采用的具体技术方案如下：

3、本发明提供一种天然水体中胞内外dna精准提取的方法，具体如下：

4、向含有透明胞外聚合物颗粒的目标水体中加入能够和金属离子结合的提取剂，得到混合液。将混合液进行震荡处理，使提取剂与目标水体中的透明胞外聚合物颗粒充分反应。待目标水体中的透明胞外聚合物颗粒完全破裂，并将其上的胞内外dna完全释放到目标水体后进行离心处理，得到含有所有胞内外dna的上清液。将上述上清液通过0.22μm滤膜过滤处理，将胞外dna收集到滤液中，胞内dna收集到滤膜上，完成含透明胞外聚合物颗粒的目标水体中的胞内外dna精准分离。

5、上述提取剂采用乙二胺四乙酸、焦磷酸钠或六偏磷酸钠中的一种。

6、作为优选，上述提取剂与目标水体按照体积比为1:(1～10)的比例混合。

7、作为优选，上述乙二胺四乙酸的浓度为0.001mm～10mm；

8、作为优选，上述焦磷酸钠的浓度为1mm～20mm。

9、作为优选，上述六偏磷酸钠的浓度为0.01mm～15mm。

10、作为优选，上述震荡处理的条件为：震荡速度为150～250rpm，震荡时间为1～3h，震荡温度为4～10℃。

11、作为优选，上述离心处理的条件为：离心速度为6000～12000rpm，离心时间为10～30min，离心温度为4～25℃。

12、作为优选，上述过滤处理使用真空抽滤方法。

13、作为优选，上述滤液中的胞外dna使用血液游离循环核酸提取试剂盒提取剂。

14、作为优选，上述滤膜上的胞内dna使用土壤基因组dna提取试剂盒提取。

15、本发明相对于现有技术而言，具有以下有益效果：

16、(1)本发明提供的提取剂性价比高、容易获得，污染较小，且对生物膜和dna没有破坏作用，不会使细胞内的胞内dna因为细胞膜破碎而被释放出来成为胞外dna，也不会破坏dna分子片段影响检测结果；

17、(2)本发明提供的提取方法适用于淡水、海水各种水体中的胞内外dna提取，且提取效果好；

18、(3)本发明提供的提取方法将水体中透明胞外聚合物颗粒中的胞外dna全部释放出来，能够准确定量水体中的胞外dna含量，解决了以往水体中胞外dna含量被低估的问题，适用于水生生物量的估计动物的食性分析、种群大小和种群动态、抗性基因、功能基因等方面的研究。

技术特征：

1.一种天然水体中胞内外dna精准提取的方法，其特征在于，具体如下：向含有透明胞外聚合物颗粒的目标水体中加入能够和金属离子结合的提取剂，得到混合液；将所述混合液进行震荡处理，使提取剂与目标水体中的透明胞外聚合物颗粒充分反应；待目标水体中的透明胞外聚合物颗粒完全破裂，并将其上的胞内外dna完全释放到目标水体后进行离心处理，得到含有所有胞内外dna的上清液；将所述上清液通过0.22μm滤膜过滤处理，将胞外dna收集到滤液中，胞内dna收集到滤膜上，完成含透明胞外聚合物颗粒的目标水体中的胞内外dna精准分离；

2.根据权利要求1所述天然水体中胞内外dna精准提取的方法，其特征在于，所述提取剂与目标水体按照体积比为1:(1～10)的比例混合。

3.根据权利要求1所述天然水体中胞内外dna精准提取的方法，其特征在于，所述乙二胺四乙酸的浓度为0.001mm～10mm。

4.根据权利要求1所述天然水体中胞内外dna精准提取的方法，其特征在于，所述焦磷酸钠的浓度为1mm～20mm。

5.根据权利要求1所述天然水体中胞内外dna精准提取的方法，其特征在于，所述六偏磷酸钠的浓度为0.01mm～15mm。

6.根据权利要求1所述天然水体中胞内外dna精准提取的方法，其特征在于，所述震荡处理的条件为：震荡速度为150～250rpm，震荡时间为1～3h，震荡温度为4～10℃。

7.根据权利要求1所述天然水体中胞内外dna精准提取的方法，其特征在于，所述离心处理的条件为：离心速度为6000～12000rpm，离心时间为10～30min，离心温度为4～25℃。

8.根据权利要求1所述天然水体中胞内外dna精准提取的方法，其特征在于，所述过滤处理使用真空抽滤方法。

9.根据权利要求1所述天然水体中胞内外dna精准提取的方法，其特征在于，所述滤液中的胞外dna使用血液游离循环核酸提取试剂盒提取。

10.根据权利要求1所述天然水体中胞内外dna精准提取的方法，其特征在于，所述滤膜上的胞内dna使用土壤基因组dna提取试剂盒提取。

技术总结
本发明公开了一种天然水体中胞内外DNA精准提取的方法，属于生物领域中的DNA提取技术。该方法向含有透明胞外聚合物颗粒的目标水体中加入能够和金属离子结合的提取剂，使透明胞外聚合物颗粒均匀分散后在提取剂的作用下完全破裂，并将其上的胞内外DNA释放到目标水体后进行离心处理，得到含有所有胞内外DNA的上清液。将上清液通过滤膜过滤处理，将胞外DNA收集到滤液中，胞内DNA收集到滤膜上，完成目标水体中的胞内外DNA精准分离。本发明可以有针对性的、精准提取天然水体中的胞内外DNA，解决水体中传统胞外DNA提取方法对胞外DNA含量严重低估的问题，对于水生生物生态系统中微生物群落结构、抗性基因、功能基因、物质循环等方面的研究有重要意义。

技术研发人员：王潇男,郑洁琰,何烨晨,孙悦,张道勇,潘响亮
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13