一种通过多糖絮凝剂处理收集微藻制备生物柴油的方法

本发明涉及生物工程与能源领域，具体涉及一种通过多糖絮凝剂处理收集微藻制备生物柴油的方法。

背景技术：

1、在化石能源日益枯竭且温室效应等环境问题日益突出的今天，开发新型、经济的清洁能源已迫在眉睫。生物柴油是由生物来源的油脂与短链醇甲醇或乙醇，在催化剂的作用下发生酯化及转酯化反应生成的长链脂肪酸甲酯或者乙酯，主要由碳氢元素构成，燃烧后排放的有毒气体含量大大降低。既可作为燃料单独使用，也可与石化柴油以不同比例调和使用，并且可直接用于柴油机而不需要对柴油机做任何改变，是一类环保、可再生的清洁能源。

2、由于微藻细胞中所含有的油脂量约占细胞干重的20％～70％，且微藻细胞具有很高的生长速率，所以利用微藻制备生物燃料已经成为国内外各大研究机构的研究热点。利用微藻生产生物燃料主要经过藻种选育、大规模培养、微藻收集、油脂的提取、油脂的转化等环节，其中，微藻收集是控制成本的主要环节。目前，主要通过离心法收集微藻，但此方法成本太高，且能耗大。高分子多糖絮凝剂无毒、可生物降解，同时它与微藻的化学成分类似，对微藻的后续加工和应用没有不良的影响，不需要再次分离，可与微藻一起应用于食品工业、生物医药和生物柴油等领域，通过絮凝法收集微藻效率高且较为经济。

3、从微藻中提取油脂用于制备生物柴油最常用的方法是催化酯化法，通常以甲醇作为底物，以强酸或强碱作为催化剂，但此方法所使用的强酸和强碱对设备腐蚀严重，工艺流程长，操作麻烦，醇油比较高且环境污染严重。甘油做为副产物会增加生物柴油的粘度，因此甘油的分离过程就增加了生产过程的成本。因此，需要一种经济、降低污染的制备生物柴油的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种通过多糖絮凝剂处理收集微藻制备生物柴油的方法，其可以解决上述背景技术提出的技术问题。

2、在本发明的一个方面，本发明提出了一种微藻的絮凝方法。根据本发明的实施例，包括以下步骤：将微藻培养至一定浓度得到微藻培养液，添加多糖絮凝剂，使微藻絮凝沉降。

3、另外，根据本发明上述实施例的一种微藻的絮凝方法，还可以具有如下附加的技术特征：

4、在本发明的一些实施例中，微藻培养包括以下步骤，将微藻种子液培养到对数生长期，接种到新鲜bg11培养基内(ph＝7)，微藻种子液和新鲜培养基的体积比为1:5～1:9，培养温度为25-30℃，培养光照条件为2000-3000lx，培养时间为7-15天，所述微藻为小球藻或铜绿微囊藻。

5、在本发明的一些实施例中，微藻絮凝沉降包括以下步骤，称取多糖絮凝剂，所述多糖絮凝剂为右旋糖酐-甜菜碱阳离子絮凝剂粉末，将多糖絮凝剂溶于蒸馏水中配制成浓度为1g/l的右旋糖酐-甜菜碱阳离子絮凝剂母液，取适量微藻培养液，调节ph至2-8，在40-80rpm/min的搅拌速度下，加入终浓度1-15mg/l的右旋糖酐-甜菜碱阳离子絮凝剂，继续搅拌5-15min后静置10-100min，即可实现微藻的絮凝。其中，所述多糖絮凝剂依据公开号为cn114890525a、名称为“一种右旋糖酐-甜菜碱阳离子絮凝剂的制备方法及其应用”的方法制备。

6、在本发明的另一个方面，本发明提出了一种通过多糖絮凝剂处理收集微藻制备生物柴油的方法。根据本发明的实施例，利用所述的微藻的絮凝方法将微藻絮凝沉降，然后将微藻烘干研磨成藻粉，使用甲醇和石油醚分步提取微藻中的油脂得到微藻油脂，以脂肪酶为催化剂，加入碳酸二甲酯进行酶催化反应，即得到生物柴油，其中，微藻为小球藻。

7、另外，根据本发明上述实施例的一种通过多糖絮凝剂处理收集微藻制备生物柴油的方法，还可以具有如下附加的技术特征：

8、在本发明的一些实施例中，微藻烘干温度为40-50℃。

9、在本发明的一些实施例中，使用甲醇和石油醚分步提取微藻中的油脂具体包括以下步骤：称取一定量的藻粉，加入甲醇重悬藻粉，利用超声破碎将细胞充分破坏，然后水浴保温，离心转移上清；再加入石油醚重悬藻粉，水浴保温，离心转移上清；将得到的两种上清液混合，并加入等量体积的水，摇匀后静置，收集上层石油醚层，蒸干石油醚，即得到微藻油脂。

10、在本发明的一些实施例中，甲醇与藻粉的比例为5:1-20:1v/w，超声破碎的功率为200-250w，超声破碎的时间为20-30min；石油醚与藻粉的比例为5:1-20：1v/w；水浴温度均为30℃，水浴保温时间均为4-6h，石油醚的蒸干温度为40-50℃，微藻脂质提取率为51.2％-82.5％。

11、在本发明的一些实施例中，所述脂肪酶为梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶。

12、在本发明的一些实施例中，所述梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的制备方法包括以下步骤：

13、(1)以来源于梳棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶基因genebank:abv69591.1为模板，将该酶命名为tll291，以kpni-xbai为克隆位点将其插入到ppiczαa载体中，通过pcr扩增技术，得到重组表达质粒ppiczαa-tll291，将重组表达质粒转化到毕赤酵母gs115感受态细胞中，经过博来霉素抗性筛选、酶切、电转化和sds-page验证后获得能够稳定表达脂肪酶tll291的基因工程菌；

14、(2)使用步骤(1)中构建脂肪酶基因工程菌种子液按照1％v/v接种量转接到ypd液体培养基(1％酵母粉、2％胰蛋白胨、2％葡萄糖、100μg/ml博来霉素)中培养24h，然后转接入bmgy培养基(100mm磷酸钠缓冲液(ph 6.0)、1％酵母粉、2％胰蛋白胨、0.34％无氨基酸酵母氮源(ynb)、4x10-5％生物素、1％甘油、100μg/ml博来霉素)中培养24h，收集菌体重新分散于bmmy培养基(100mm磷酸钠缓冲液(ph 6.0)、1％酵母粉、2％蛋白胨、0.34％无氨基酸酵母氮源(ynb)、4x10-5％生物素、1％甲醇、100μg/ml博来霉素)中，每24h添加0.5％-2％v/v的甲醇进行诱导培养，诱导培养72-120h后，离心除去菌体，即可得到脂肪酶，将酶液离心超滤浓缩备用。

15、在本发明的一些实施例中，所述步骤(2)中，整个培养过程维持220r/min、28℃。

16、在本发明的一些实施例中，所述微藻油脂与碳酸二甲酯摩尔比为1:2-1:8，脂肪酶添加量终浓度为100-200μg/ml，在30-50℃、220r/min摇床中反应48-96h，生物柴油得率为45.3％-79.8％。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

18、1)本发明通过优化得到最佳的接种密度、培养温度和光照，使藻体生长得到最大量的油脂积累，提高油脂得率。

19、2)本发明微藻收集过程使用絮凝法。通过添加多糖絮凝剂使小球藻沉降下来，提高了采集效率，降低了生物柴油的生产成本。铜绿微囊藻的爆发会对水体产生污染，使用絮凝剂处理，有利于净化水质，而且多糖絮凝剂可以被降解，不会产生二次污染。

20、3)微藻油脂的提取使用甲醇和石油醚作为提取剂，相较甲醇-氯仿体系毒性大大降低，有利于保护环境和身体健康。

21、4)生物柴油制备过程采用酯交换法，以脂肪酶作为催化剂，使用碳酸二甲酯作为底物，副产物甘油碳酸脂则是一种高附加值产品，有利于生产过程的整体经济性；其次，反应条件温和，降低了生产工艺要求和生产成本。