一株硝基还原假单胞菌A-4及其在降解3-苯氧基苯甲酸中的应用

本发明属于生物，尤其涉及一株硝基还原假单胞菌(pseudomonasnitroreducens)a-4及其在降解3-苯氧基苯甲酸中的应用。

背景技术：

1、拟除虫菊酯类农药是以天然除虫菊素为先导物合成的一类仿生型杀虫剂，具有广泛性、高效性及低残留等特点，是未来几十年难以替代的农药类型之一。研究表面拟除虫菊酯已在环境，尤其是水体环境中广泛检出，同时其存在很强的水生毒性和显著的内分泌干扰效应。然而，鉴于它们具有降解快，哺乳动物急性毒性低等优点，被广泛应用于农业生产和室内卫生害虫防治等。随着研究的深入，近来的研究发现拟除虫菊酯的转化产物同样具有内分泌干扰效应，且具有比母体化合物更高的持久性。而在众多转化产物中，3-苯氧基苯甲酸(3-pba)是大多数拟除虫菊酯的主要降解产物之一，其疏水性相对较弱，毒性和迁移性强于母体农药，属雌激素类物质，具有一定的生殖毒性，易被动植物吸收。而且3-苯氧基苯甲酸在造成二次污染的同时，也导致农药生物矿化作用受阻，从而限制了农药的生物降解途径，间接地使土壤、水体、农产品或食品中农药残留问题更加严峻。因此，如何消除环境中的3-苯氧基苯甲酸已受到广泛关注。

2、生物降解法以其条件温和、高效无毒、无二次污染及生态协调等特点被认为是一种有效的农药污染“绿色”解决方案。但在目前国内外筛选获得的可降解3-苯氧基苯甲酸的降解菌主要来自于农药污染土壤和酱油曲料中，如从农药污染土壤中筛选得到的芽孢杆菌(bacillus sp.)，以及从酱油曲料中分离的米曲菌(aspergillus oryzae)等。这些筛选得到的3-pba降解菌种类较少，且未见从农田河道底泥中分离出3-pba降解菌，所以迫切需要从农田河道底泥中筛选3-pba降解菌，以期为环境中3-pba类农药残留的生物降解提供菌株资源。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一株硝基还原假单胞菌a-4及其在降解3-苯氧基苯甲酸中的应用。

2、本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一株硝基还原假单胞菌a-4，命名为硝基还原假单胞菌(pseudomonas nitroreducens)a-4，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号：cctcc m 20221990，保藏日期2022年12月19日；它的16s rrna序列如seq id no.1所示。

3、本发明所述的硝基还原假单胞菌a-4在降解3-苯氧基苯甲酸中的应用。

4、进一步地，所述应用具体为：将硝基还原假单胞菌a-4经含菌悬液接种至液体mm培养基中，以3-苯氧基苯甲酸(3-pba)为唯一碳源，所述碳源的质量浓度为25mg/l～150mg/l，在培养温度为30℃～37℃、摇床转速为160r/min、培养时间为72h～120h、ph为5.0～9.0的培养条件下进行培养，以将mm培养基中的3-苯氧基苯甲酸(3-pba)降解。

5、进一步地，所述液体mm培养基按质量浓度计，由碳源25mg/l～150mg/l、硫酸铵0.15％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸氢二钾0.15％、硫酸镁0.02％、氯化钠0.05％加去离子水至100％制成，所述液体mm培养基的初始ph为7.0～7.5。

6、可选地，所述液体mm培养基按质量浓度计(w/v)组成为：碳源100mg/l、硫酸铵1.5g、磷酸氢二钾0.5g、磷酸氢二钾1.5g、氯化钠0.5g、硫酸镁0.2g和去离子水1l，所述液体mm培养基的初始ph＝7.5。

7、进一步地，所述含菌悬液通过以下步骤制备获取：

8、(1)制备lb种子培养基，所述lb种子培养基按质量浓度计包括：氯化钠10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母膏5g/l和溶剂，所述溶剂为水；

9、(2)将所述液体mm培养基加琼脂以获取固体mm培养基；

10、(3)从所述固体mm培养基的菌体中挑取菌落接种至lb种子培养基，在30℃培养12h，以获取种子液，即含菌悬液。

11、可选地，所述lb种子培养基按质量浓度计(w/v)组成为：氯化钠(nacl)10g、胰蛋白胨10g、酵母膏5g和溶剂为水1l，所述lb种子培养基的初始ph＝7.0。

12、进一步地，所述含菌悬液的od600值为0.8～1.0，所述含菌悬液的体积接种量为5％(v/v)。

13、进一步地，所述培养温度为37℃，所述ph为7.0～8.0，所述碳源(即3-pba)的质量浓度为100mg/l。

14、进一步地，所述ph为7.5。

15、进一步地，所述降解在ph为7.5，3-pba浓度为25mg/l、50mg/l、75mg/l、100mg/l、150mg/l条件下进行。

16、进一步地，所述降解在ph为7.5，3-pba浓度为100mg/l，温度为30℃、35℃、37℃条件下进行。

17、进一步地，所述降解在ph为7.5，3-pba浓度为100mg/l，温度为37℃条件下进行。

18、与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的菌株在120h内能对初始浓度为100mg/l的3-pba降解率分别达到74％，该菌株在拟除虫菊酯转化产物3-苯氧基苯甲酸中有明显的降解作用，具有较好的应用潜力，该降解菌的发现对生物降解的进一步研究具有重要意义。

技术特征：

1.一株用于降解3-苯氧基苯甲酸的硝基还原假单胞菌a-4，其特征在于，命名为硝基还原假单胞菌(pseudomonas nitroreducens)a-4，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号：cctcc m 20221990，保藏日期2022年12月19日；它的16s rrna序列如seq id no.1所示。

2.一种如权利要求1所述的硝基还原假单胞菌a-4在降解3-苯氧基苯甲酸中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用具体为：将硝基还原假单胞菌a-4经含菌悬液接种至液体mm培养基中，以3-苯氧基苯甲酸为唯一碳源，所述碳源的质量浓度为25mg/l～150mg/l，在培养温度为30℃～37℃、摇床转速为160r/min、培养时间为72h～120h、ph为5.0～9.0的培养条件下进行培养，以将mm培养基中的3-苯氧基苯甲酸降解。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述液体mm培养基按质量浓度计，由碳源25mg/l～150mg/l、硫酸铵0.15％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸氢二钾0.15％、硫酸镁0.02％、氯化钠0.05％加去离子水至100％制成。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述含菌悬液通过以下步骤制备获取：

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述含菌悬液的od600值为0.8～1.0，所述含菌悬液的体积接种量为5％。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述培养温度为37℃，所述ph为7.0～8.0，所述碳源的质量浓度为100mg/l。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述ph为7.5。

9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述降解在ph为7.5，3-pba浓度为25mg/l、50mg/l、75mg/l、100mg/l、150mg/l条件下进行。

10.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述降解在ph为7.5，3-pba浓度为100mg/l，温度为30℃、35℃、37℃条件下进行。

技术总结
本发明公开了一株硝基还原假单胞菌A‑4及其在降解3‑苯氧基苯甲酸中的应用，所述硝基还原假单胞菌A‑4命名为硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)A‑4，所述硝基还原假单胞菌A‑4保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号：CCTCC M 20221990，保藏日期2022年12月19日。本发明的菌株在120h内能对初始浓度为100mg/L的3‑PBA降解率分别达到74％，该菌株在拟除虫菊酯转化产物3‑苯氧基苯甲酸中有明显的降解作用，具有较好的应用潜力，该降解菌的发现对生物降解的进一步研究具有重要意义。

技术研发人员：徐超,朱媛巧,牛丽丽,袁曙光,张礼治,姚雨霖,金敏慧,杨璇
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16