一种氨基脂质、其合成方法、颗粒及用途与流程

本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种氨基脂质、其合成方法、颗粒及用途。

背景技术：

1、在用于用核酸等生物活性剂转染细胞的各种试剂，药用载体中，基于脂质体的包封传送已经公知是最有效的。这大部分是由于它们的效率和易于使用。脂质体是人工制备的由脂质双层制得的球形泡囊。为了将分子传送至作用位点，脂质双层可以与其他双层(如细胞膜)融合，由此在细胞内部传送脂质内含物。

2、由于其独特的特性，脂质体用于药物传送。脂质体在疏水性膜内包括一些水溶液；溶解的亲水性溶质不能容易地通过脂质。疏水性化合物物质可以溶解至膜中，并且以这样的方式，脂质体可以同时携带疏水性分子和亲水性分子。脂质体可以结合生物活性剂，如药物、核酸、肽等，并且用于传送这些物质，用于调控细胞生化途径。这打开了疾病新治疗的可能性。

3、对于荷负电核酸的传送，可电离的阳离子脂质是最有效的载体。阳离子脂质表示一类有前景的用于dna传送的合成材料。迄今为止，存在的几种商业化阳离子脂质，但能安全且高效传送基因的阳离子脂质的数量仍然是有限的。

4、在“cationic liposomes for gene therapy(用于基因治疗的阳离子脂质体)”(miller ad，angew chem int ed.1998,37:1768-1785)中，描述了大部分常用的和可购得的转染剂。然而，常规脂质合成通常需要单独优化的、多步骤合成，包括时间密集性程序，如化合物保护和去保护、使用和除去催化剂、溶剂交换和纯化。

5、阳离子脂质需要与天然磷脂(称为辅助脂质)结合来形成可以更有效地结合至细胞膜中的脂质体。通过将脂质体结合dna或药物(其单独不能通过靶细胞的膜扩散)，它们可以(无差别地)通过脂质双层传送。这种使用脂质体将dna转化或转染至宿主细胞中称为脂转染。

6、细胞治疗是通过体外基因编辑靶细胞，使这些细胞具有增强免疫、杀死病原体或肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等功能，再重新把它们输回病人体内，从而达到治疗的目的。由于直接注射外源基因或蛋白，它们的利用率低，血液循环中半衰期短，重复注射毒性高，因此基因治疗往往需要载体的帮助，有效的基因传递载体应具备以下几个特点:1，进入血液循环后，能逃避res清除，避免被巨噬细胞吞噬。2，能有效地进入细胞内，并逃避溶酶体的降解。3，dna能有效地进入细胞核并高效表达。目前，绝大多数的基因传递载体并不完美，都存在诸如低效、制备困难等问题，如何设计制备高性能的基因传递载体(转染载体)已成为生物医学领域的关键问题所在。(al-dosari,m.s.,and gao,x.(2009).nonviralgene delivery:principle,limitations,and recent progress.the aaps journal 11,671-681.)

7、基因传递载体的其中一个应用就是干细胞移植治疗，目前，它是治疗肿瘤疾病、神经系统疾病以及免疫系统疾病等积极有效的一种方式。干细胞因其可以分化成多种细胞的特性，尤其适合应用于中枢神经系统疾病，例如唐氏综合征，造血系统恶性肿瘤疾病，例如白血病，免疫系统疾病，例如艾滋病等等疾病的治疗。以干细胞治疗为核心的组织工程及再生医学，已成为药物、手术治疗后的另一种疾病治疗途径。(shi y,inoue h,wu jc,yamanaka s.induced pluripotent stem cell technology:a decade of progress.natrev drug discov.)

8、尽管脂质体试剂表示了现有技术关于细胞转染剂的状况，但它们具有以下缺陷：

9、1：现有脂质体的载药量及包封率，转染效率(脂质体与细胞膜的有效融合)与细胞毒性及缓释作用无法很好地兼顾平衡。

10、2：脂质体的不稳定性，导致脂质体-有效成分例如mrna等的储存条件严苛，造成较大的边际成本。

11、3：目前用于基因编辑的非病毒载体，其成本、效率、细胞普适性(尤其是干细胞)等方面都不尽人意，无法很好适应科学研究者对细胞调控的要求，所以，开发新的基因传递载体非常有必要。

12、现在对于问题2的通用的解决方案是加入peg来保护脂质体，增加脂质体结构的稳定性，peg脂质中的醚结构等特性有助于保护颗粒及其内含物免受体外或体内降解，并且提高了体内循环时间。其可以用于脂质体药物传送中(peg-脂质体)。但是peg化脂质仍然存在相应的问题。peg链的空间位阻抑制靶细胞摄取脂质体，peg干扰基因和蛋白药物携带的ph敏感脂质体(ph-sensitive liposomes，psl)的“核内逃逸”，导致这些药物在溶酶体中降解；另外在同一动物体内反复注射peg化脂质体可引起“血液清除加速”现象。这一系列的负面影响被称为“peg困境”。“peg困境”给peg化脂质体的发展带来了严峻的挑战。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种氨基脂质、其合成方法、颗粒及用途，该合成的氨基脂质具有较好的稳定性和转染效率。

2、所采用的技术方案为：

3、本发明的一种氨基脂质，其具有如下通式(i)结构：

4、

5、r3和r4相同或不同，并且独立地是取代的c1-c12烷基，其取代基团可以任选自羟基、氨基或氢，或者r3和r4成环；

6、r5不存在或是氢或c1-c12烷基；

7、r2是c6-c10烷基,或取代的烯基；

8、r1是c6-c20的单链或是双链烷基，或取代的含s、o或n的c6-c20单链或是双链的烷基；

9、y是

10、进一步地，该氨基脂质的一个化学结构如下：

11、

12、本发明的一种上述所述的氨基脂质的合成方法，包括以下步骤：

13、将具有通式(ii)结构的胺与具有通式(iii)结构的羧酸进行酯化反应得到具有通式(i)结构的氨基脂质；

14、

15、本发明的另一种上述所述的氨基脂质的合成方法，包括以下步骤：

16、s1.将含有r3、r4和r5结构的胺与含有环氧烷结构的羧酸进行羧基与氨基的酯化反应；

17、s2.将环氧烷进行开环反应，得到具有通式(i)结构的氨基脂质。

18、进一步地，包括如下反应：

19、s1.羧基与氨基的反应如下：

20、

21、

22、s2.环氧烷开环反应如下：

23、

24、该环氧烷开环反应为亲核反应，环氧化物与胺反应干净，产生氨基醇。对于环氧化物，会产生良好的效果。

25、环氧烷开环反应原理参见r.t.morrison r.n.boyd的(organic chemistry(4thed)和rj.fessenden j.sfessenden编的《organicchemistry》

26、

27、进一步地，步骤s1中的胺为如下的一种：

28、

29、

30、进一步地，步骤s1中的胺的r3、r4含-oh，-o-,＝o的头部。

31、进一步地，步骤s1中的含有环氧烷结构的羧酸为如下的一种结构：

32、

33、

34、进一步地，参与步骤s2中的环氧烷开环反应的物质包括如下的一种：单链烷基、双链烷基、oh-n-双链烷基、cooh-双链烷基。

35、单链烷基例如为：

36、

37、双链烷基例如为：

38、

39、oh-n-双链烷基例如为：

40、

41、cooh-双链烷基例如为：

42、

43、本发明的一种氨基脂质的筛选方法，包括如下步骤：使不同的氨基脂质与给定类型的细胞接触，并确定哪种氨基脂质具有所需的特性，所述特性包括所需的转染效率和/或稳定性。所需特性还可以包括细胞毒性、待传送至细胞中的药剂的粘附、氨基脂质的大小等。本发明的筛选方法可以形成特定适应的氨基脂质，以用于特定的应用。

44、本发明的一种氨基脂质文库，其通过上述所述的筛选方法集合了所需特性的氨基脂质。

45、本发明的一种氨基脂质颗粒，其包含上述所述的氨基脂质。

46、进一步地，氨基脂质颗粒还包含非阳离子脂质、固醇和/或生物活性剂。

47、进一步地，所述生物活性剂包括核酸、抗肿瘤剂、抗生素、免疫调节剂、抗炎剂、作用于中枢神经系统的药物、多肽和多肽类中的一种或多种。其中生物活性剂是核酸，包括但不限于rna、反义寡核苷酸、dna、质粒、核糖体rna(rrna)、微rna(mirna)、转移rna(trna)、小的抑制rna(sirna)和小的核rna(snrna)。生物活性剂还可以是抗肿瘤剂、抗生素、免疫调节剂、抗炎剂、作用于中枢神经系统的药剂、抗原或其片段、蛋白、肽、多肽类、疫苗和小分子，或其混合物。

48、本发明的氨基脂质颗粒制备用于将生物活性剂传送至细胞中的药物的用途。术语“细胞”意思是一般术语，并且包括单个细胞、组织、器官、昆虫细胞、禽类细胞、鱼细胞、两栖类细胞、哺乳动物细胞、初级细胞、连续细胞系、干细胞和或遗传工程化细胞(如，表达异源多肽或蛋白的重组细胞)的培养。重组细胞包括，例如，表达异源多肽或蛋白(如生长因子或血液因子)的细胞。

49、进一步地，所述药物用于病毒感染、肝病或失调、或癌症治疗。在肝病中，氨基脂质颗粒可以被网状内皮系统的细胞捕获，网状内皮系统主要位于肝中。氨基脂质颗粒将在那聚集。

50、本发明的有益效果在于：

51、1.长双链使得新的阳离子脂质降低体内代谢，起到缓释所用，及降低细胞毒性的作用。

52、2.引入及-o-，＝o的结构，lnp合成过程中均需要弱酸性环境，ph＝5或6，这样，易于合成，但保持稳定的条件需要是弱碱性条件，也就是ph在7或7以上，-oh引入，使得最后形成的lnp-mrna产物更加稳定。同时也具有很好的转染效率。

53、3.文库的形式，上百种不同的阳离子氨基脂质氨基脂质，以快速筛选方式筛选出针对不同有效成分的最优氨基脂质氨基脂质。

54、4.此类氨基脂质在干细胞转染上具有良好的表现，是可以用于细胞治疗的非病毒载体。

55、5.现有能获取的原料中的羧基双链的原料均为短链(c小于10)，缺少了长尾链的氨基脂质结构稳定性较差。现有方法是多加支链来解决这个问题，而本发明是以环氧烷的开环反应在长羧基单链加入新的单链来实现长双链的结构，以增加结构稳定性。

56、6.原料易得，反应简单易于合成，并且经济实用。环氧烷开环反应增加尾链条件简单，原料易得，并且属于弱碱性环境下的反应。