一种以地下部分入药药材的DNA提取方法

本发明属于生物，具体涉及一种以地下部分入药药材的dna提取方法。

背景技术：

1、目前，分子生物学技术已被广泛应用于中药材鉴定等方面，其中dna的提取是中药材研究的重要基础，快速有效地大量提取高质量的dna是对中药材进行基因文库构建、基因分离、遗传转化及分子鉴定的重要前提。然而大多数中药材经过加工处理后，其中所含的dna可能会受到不同程度的降解，dna的完整性受到破坏；其次，中药材含有的次生代谢物也影响其dna的提取效果及后续研究。

2、以地下部分入药药材在中国药典616种中药材中占27.92％，包括根和根茎类、根类、根茎类、块根类、块茎类及鳞茎类药材，为中国药典中主要部分之一，广泛应用于临床中。这些药材中多数野生资源匮乏，市场供不应求，掺伪现象严重，而传统的鉴定方法有一定局限性，分子鉴定是一种有效鉴别途径。因此，如何有效地提取高质量的dna是保证快速有效分子检测的前提和基础。但由于以地下部分入药的药材多为干品，含有大量的次生代谢产物，特别是淀粉、多糖等物质严重影响了dna的提取效果。常规的ctab法和sds法能得到浓度高的dna模板，但纯度较低；试剂盒法能得到纯度高的dna模板，但浓度较低。因此，急需优化提取方法，获得浓度与纯度兼顾的dna模板。本发明在ctab法和试剂盒法的基础上对已有的dna提取方法进行优化，建立一种有效和高质量的以地下部分入药药材的基因组dna提取方法。

技术实现思路

1、为解决目前以地下部分入药药材dna提取过程中的上述问题，本发明的目的在于提供一种以地下部分入药药材的dna提取方法，采用改良的提取试剂，包括核裂解液、2×ctab缓冲液、淀粉酶、蛋白酶k、rnasea，使用优化的dna提取过程，包括将ctab步骤与试剂盒法相结合来提取以地下部分入药药材的dna，次生代谢产物去除率高，dna完整性好，提取方法简单易控制，能够满足后续分子生物学实验的要求。

2、本发明的目的采用如下技术方案实现：

3、一种以地下部分入药药材dna提取试剂，包括核分离液、2×ctab缓冲液、淀粉酶、蛋白酶k、rnasea，所述核分离液包括：1.4mol/l nacl，0.1mol/l tris-hcl(ph 8.0)，0.02mol/l edta(ph 8.0)，0.4％β-巯基乙醇，3％ pvp40，ddh2o定容至1000ml。

4、优选地，所述核分离液包括：nacl 81.82g，1mol/l tris-hcl(ph 8.0)100ml，0.5mol/l edta(ph 8.0)40ml，β-巯基乙醇4ml，pvp40 30g，ddh2o定容至1000ml。

5、tris-hcl(ph8.0)主要是提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；edta螯合mg2+或mn2+离子，抑制dnase活性；nacl提供一个高盐环境，使脱氧核糖核蛋白可溶；pvp40能与多糖、多酚结合形成不溶物，有效去除多酚、多糖；β-巯基乙醇是一种抗氧化剂，能够防止酚类物质被氧化发生褐变，使酚类物质容易被去除。

6、进一步地，所述2×ctab缓冲液包括：0.055mol/l ctab，1.4mol/l nacl，0.1mol/ltris-hcl(ph 8.0)，0.02mol/l edta(ph 8.0)，0.2％β-巯基乙醇，1％pvp40，ddh2o定容至1000ml。

7、优选地，所述ctab缓冲液包括：ctab 20g，nacl 81.82g，1mol/l tris-hcl(ph8.0)100ml，0.5mol/l edta(ph 8.0)40ml，β-巯基乙醇2ml，pvp40 10g，ddh2o定容至1000ml。

8、ctab(十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物，使其分离。

9、进一步地，所述淀粉酶、蛋白酶k、rnasea包括：0.1％淀粉酶10μl，100μg/μl蛋白酶k 25μl，10μg/μl rnasea 5μl。

10、基于以上改进的试剂配方，具体的dna提取步骤包括：

11、核分离液预处理：将研磨好的地下部分入药药材粉末与核分离液充分混合，剧烈振荡后离心，弃上清液，得到混合样本；

12、2×ctab缓冲液处理：向混合样本中加入2×ctab缓冲液，振荡混匀。

13、酶处理：向混合样本中加入淀粉酶、蛋白酶k、rnasea，振荡混匀，进行恒温孵育。

14、提取步骤处理：采用天根新型植物基因组dna提取试剂盒操作步骤4，5，6，7，8，9步。

15、进一步地，所述以地下部分入药药材粉末的质量与核分离液的体积比为(0.8-1.0):(6.0-7.0)。

16、所述混合样本与2×ctab缓冲液的体积比为(0.9-1.1):(0.9-1.1)。

17、所述恒温孵育的条件为：56℃水浴8-12h。

18、优选地，所述恒温孵育的条件为：56℃水浴12h。

19、相比现有技术，本发明的有益效果在于：

20、1、本发明以地下部分入药药材dna提取方法在ctab处理前先进行核分离液预处理，核分离液配方与后续的ctab缓冲液近似，可减少dna的降解；核分离液增加了nacl浓度，提供高盐环境，使dna更容易充分溶解；核分离液中增加了pvp-40(聚乙烯吡咯烷酮)和β-巯基乙醇复合作用，在核分离阶段即进行次生代谢产物的分离，去除效果更好，更能保持dna的完整性；ctab缓冲液中添加pvp-40和β-巯基乙醇复合作用，进一步去除核酸提取液中的次生代谢产物。其中，pvp-40是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物，有效去除待提取样本中的多酚，减少dna中酚的污染，同时它也能和多糖结合，有效去除多糖；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效防止酚氧化成醌，避免褐变，并使酚更多的与pvp-40络合，使酚更容易去除。

21、2、ctab(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物；它具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在该条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里。该复合物在高盐溶液中(nacl>0.7mol/l)是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸从中分离出来。

22、3、淀粉酶、蛋白酶k、rnasea可降解dna中的淀粉、蛋白质、rna等杂质的影响，从而得到高纯度的dna。

23、4、本发明以地下部分入药药材dna提取方法进一步优化了处理试剂、处理温度、处理时间、提取步骤等工艺参数。调节处理温度与处理时间为56℃、12h，使样品更好与ctab结合，使反应更充分。结合使用试剂盒中的步骤能更好进行dna提取，且获高纯度、高质量的基因组dna。

技术特征：

1.一种以地下部分入药药材dna提取试剂，其特征在于，包括核分离液、2×ctab缓冲液、淀粉酶、蛋白酶k、rnasea，所述核分离液包括：1.4mol/lnacl，0.1mol/l tris-hcl(ph8.0)，0.02mol/l edta(ph 8.0)，0.4％β-巯基乙醇，3％pvp40，ddh2o定容至1000ml。

2.根据权利要求1所述的以地下部分入药药材dna提取试剂，其特征在于，核分离液包括：nacl 81.82g，1mol/l tris-hcl(ph 8.0)100ml，0.5mol/ledta(ph 8.0)40ml，β-巯基乙醇4ml，pvp40 30g，ddh2o定容至1000ml。

3.根据权利要求1所述的以地下部分入药药材dna提取试剂，其特征在于，所述2×ctab缓冲液包括：0.055mol/l ctab，1.4mol/l nacl，0.1mol/ltris-hcl(ph 8.0)，0.02mol/ledta(ph 8.0)，0.2％β-巯基乙醇，1％pvp40，ddh2o定容至1000ml。

4.根据权利要求3所述的以地下部分入药药材dna提取试剂，其特征在于，所述2×ctab缓冲液包括：ctab 20g，nacl 81.82g，1mol/l tris-hcl(ph8.0)100ml，0.5mol/l edta(ph8.0)40ml，β-巯基乙醇2ml，pvp40 10g，ddh2o定容至1000ml。

5.根据权利要求1所述的以地下部分入药药材dna提取试剂，其特征在于，所述淀粉酶、蛋白酶k、rnasea包括：0.1％淀粉酶10μl，100μg/μl蛋白酶k 25μl，10μg/μl rnasea 5μl。

6.一种以地下部分入药药材dna提取方法，其特征在于，包括：

7.根据权利要求6所述的以地下部分入药药材dna提取方法，其特征在于，所述根或根茎药材粉末的质量与核分离液的体积比为(0.8-1.0):(6.0-7.0)。

8.根据权利要求6所述的以地下部分入药药材dna提取方法，其特征在于，所述混合样本与2×ctab缓冲液的体积比为(0.9-1.1):(0.9-1.1)。

9.根据权利要求6所述的以地下部分入药药材dna提取方法，其特征在于，所述恒温孵育的条件为：56℃水浴8-12h。

10.根据权利要求8所述的以地下部分入药药材dna提取方法，其特征在于，所述恒温孵育的条件为：56℃水浴12h。

技术总结
本发明公开了一种以地下部分入药药材DNA提取方法，属于生物技术研究领域。包括提取试剂的改良，以及提取过程的优化。其中提取试剂主要是改良了核分离液的配方：1.4mol/L NaCl，0.1mol/L Tris‑HCl(pH 8.0)，0.02mol/LEDTA(pH 8.0)，0.4％β‑巯基乙醇，3％PVP40，ddH<subgt;2</subgt;O定容至1000mL；优化了提取过程：将CTAB法与试剂盒法步骤相结合，突出充分混合步骤。本发明所述DNA提取方法适用于以地下部分入药药材DNA的提取，提取方法简单易控制，次生代谢产物去除率高，污染少，能获高纯度、高质量的基因组DNA，能够满足后续PCR扩增及其他分子生物学实验的要求。

技术研发人员：李西文,冯雪,刘姿怡
受保护的技术使用者：中国中医科学院中药研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13