咔唑生物碱化合物及其制备方法与应用

本发明属于生物医药领域，具体涉及三个新颖的咔唑生物碱化合物及其提取方法，以及在制备抑制神经细胞铁死亡药物中的应用。

背景技术：

1、神经系统疾病是指神经系统的任何功能障碍，包括阿尔茨海默氏症(ad)、帕金森氏症(pd)、亨廷顿氏症(hd)、抑郁症、脑卒中、失语症、癫痫等。随着人口的老龄化趋势及人口快速增长，神经系统疾病引起的死亡和伤残临床病例也在急剧增加。尽管现代医学如今已取得了长足进步，但针对神经系统疾病的治疗发展仍然缓慢。

2、神经保护剂指的是一类能治疗和改善神经系统疾病的药物，能减少病理状况下的神经应激反应，降低炎症损伤，促进神经细胞再生和修复。根据作用机制，可对目前所有的神经保护剂进行分类，主要包括：谷氨酸阻断剂，自由基清除剂，兴奋性氨基酸调节剂，钙离子拮抗剂，免疫抑制剂等。然而，这些神经保护剂实际治疗效果并不理想，由于高选择性的血脑屏障(bbb)会阻止治疗药物进入大脑，且神经过程的复杂性及其功能衰退的不可逆性限制了潜在治疗药物作用活性靶点，这些药物都未能有效干预疾病的进展。因此，针对现行药物的缺陷，亟需开发一种新型作用机制的神经保护剂。

3、铁死亡(ferroptosis)是近些年发现的一种新颖的铁依赖性细胞程序性死亡形式，已被证实与脑卒中、阿尔茨海默氏症、创伤性脑损伤等多种神经疾病的发生发展密切相关。有研究表明，通过抑制神经细胞铁死亡能够有效降低神经损伤，是神经保护剂的潜力靶点，然而，针对该靶点的药物发掘正处于起步阶段，结构多样性的铁死亡抑制剂仍具有重要的价值。因此发掘具有铁死亡抑制作用的先导化合物具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、本发明目的是提供链霉菌streptomyces sp.hs-nf-1322中三个新颖咔唑生物碱化合物及其微生物发酵制备方法，所述的咔唑生物碱化合物通过抑制神经细胞铁死亡而产生神经保护作用，可用于制备神经保护剂。

2、本发明的技术方案如下：

3、三种咔唑生物碱化合物，antiostatin a7(1)、morindolestatin b(2)和morindolestatin c(3)，结构式如下所示：

4、

5、本发明还提供了三种咔唑生物碱化合物的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：

6、(1)采用yms培养基、发酵培养基依次对链霉菌streptomyces sp.hs-nf-1322菌株进行培养，获得种子液；

7、其中，链霉菌streptomyces sp.hs-nf-1322菌株是2017年6月从浙江天目山的土壤样品中分离得到的，根据100％16s rrna基因测序(genbank,accession no.mk027058)，表明其为链霉菌菌株，该样本已保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号cgmccno.15461；

8、具体菌株培养的操作方法如下：将链霉菌streptomyces sp.hs-nf-1322菌株在25ml yms培养基中培养7天，摇床设定为速度250rpm，温度28℃，得到种子培养物；而后将20ml种子培养物接种于含有250ml发酵培养基的1000ml锥形烧瓶中，置于温度为28℃，转速为250rpm的摇床培养2天，得到种子液；

9、yms培养基组成：麦芽提取物(10g/l)、酵母提取物(2g/l)、kno3(1g/l)、琼脂(20g/l)；

10、发酵培养基组成：葡萄糖(4g/l)、麦芽提取物(10g/l)、酵母提取物(4g/l)、caco3(2g/l)；

11、(2)利用发酵罐对步骤(1)所得种子液进行放大发酵，期间基于强化前体供应，添加链霉菌合成咔唑生物碱所需的聚酮合酶(pks)底物，发酵液离心去除菌丝体，备用；

12、具体放大发酵的操作方法如下：将种子液转移至50l发酵罐中，培养基28l，在此基础上，基于强化前体供应，添加链霉菌(合成咔唑生物碱所需的pks底物进行生产发酵)以及l-色氨酸(2g/l)、丙酮酸钠(1g/l)，保持发酵环境温度为28℃，搅拌桨转速100rpm，发酵6天，随后将所得发酵液以4000rpm转速离心6分钟，除去菌丝体，备用；

13、培养基组成为：葡萄糖(10g/l)、可溶性淀粉(40g/l)、酵母提取物(4g/l)、麦芽提取物(4g/l)、caco3(2g/l)、mgso4·7h2o(1g/l)、nacl(1g/l)、kh2po4(2g/l)；

14、(3)取步骤(2)除去菌丝体的发酵液，用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩后得到粗提取物；

15、优选乙酸乙酯与发酵液的体积比为1:1～1:2，特别优选1:1.2；

16、(4)将步骤(3)所得粗提取物进行100-200目硅胶柱层析，以体积比分别为10:1、9:1、8:2、7:3的氯仿与甲醇的混合溶液进行梯度洗脱，每个梯度分别洗脱2个柱体积，利用氯仿：甲醇＝15:1(体积比)为展开条件，经薄层层析检测后合并相同分流，得到5个组分，依次标记为组分a-组分e；

17、具体的，硅胶柱选用10cm，层析柱高度h：20cm，对应的柱体积约为1.5l；

18、粗提物质量与硅胶质量比为1:10～1:20，优选1:15；

19、(5)取步骤(4)中的组分b减压浓缩，使用葡聚糖凝胶柱层析，以体积比10:1的氯仿和甲醇的混合溶液进行洗脱，以氯仿：甲醇＝8:1(体积比)为展开条件，经薄层层析检测后合并相同rf值为0.3的流份并减压浓缩，之后通过半制备型高效液相色谱，以体积分数为98％的甲醇水溶液进行洗脱，分离得到化合物2(tr＝21.6min)和化合物3(tr＝22.5min)；

20、其中，葡聚糖凝胶柱的填料为sephadex lh-20，4cm，层析柱高度h：80cm；

21、半制备型高效液相色谱柱选用zorbax sb-c18，9.4mm，l：250mm，粒径：5μm；洗脱剂流速：1.5ml/min；

22、(6)取步骤(4)中的组分c减压浓缩，用200-300目硅胶柱层析分离，经体积比9:1、4:1、2:1、1:1正己烷与丙酮的混合溶液梯度洗脱，每个梯度分别洗脱2个柱体积，以氯仿：甲醇＝6:1(体积比)为展开条件，经薄层层析检测后合并相同rf值为0.3的流份并减压浓缩，之后通过半制备型高效液相色谱，以体积分数为40％的乙腈水溶液进行洗脱，分离得到化合物1(tr＝26.3min)；

23、其中，硅胶柱选用3cm，层析柱高度h：50cm，对应的柱体积约为1000ml；

24、半制备型高效液相色谱柱选用zorbax sb-c18，9.4mm，l：250mm，粒径：5μm；洗脱剂流速：1.5ml/min。

25、本发明所述的三种咔唑生物碱化合物可用于制备抑制铁死亡活性药物。

26、本发明所述的三种咔唑生物碱化合物的抑制铁死亡活性使用了半数有效浓度(ec50)、细胞保护作用和逆转活性氧水平三种评价方法。

27、优选的，所述抑制铁死亡活性药物为：能够抑制erastin诱导的ht22细胞及pc12细胞的细胞损伤和活性氧水平的药物。

28、与现有技术相比，本发明的有益效果表现在：

29、当给予不同剂量的化合物1-3时，能有效逆转erastin对ht22细胞和pc12细胞损伤；浓度为10μm的化合物1和2能显著降低细胞内ros水平，其抑制活性与阳性药dfo相当。上述三种新型咔唑生物碱能明显逆转erastin诱导的铁死亡，并能有效减少细胞内ros的生成，有作为新型神经保护剂的良好应用前景。