du1突变体及其编码基因、检测引物组合及应用

本发明涉及植物基因工程，具体涉及du1突变体及其编码基因、检测引物组合及应用。

背景技术：

1、玉米胚乳中储存着丰富的碳水化合物，为玉米种子的萌发提供充足的营养和能量。碳水化合物相关基因的纯合突变可改变碳水化合物的组成、性质、结构和数量，并引起玉米籽粒表型的明显变化，从而为培育多样化鲜食玉米品种奠定遗传基础。例如，淀粉缺陷型突变基因su1(甜质1)和sh2(皱缩2)通过减少底物供给限制淀粉合成，提高还原糖、蔗糖或者水溶性多糖水平，是甜玉米育种的重要种质资源；淀粉修饰基因wx(糯质)和ae(直链淀粉延伸)突变改变了淀粉中直链淀粉和支链淀粉比例，是淀粉品质遗传改良的重要种质资源。

2、研究获得新的碳水化合物相关基因或突变体有利于丰富玉米育种资源，开发它们的新的有效检测方法，有利于资源的有效利用。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种新的与玉米甜度相关的基因突变体及其检测方法。

2、本发明找到并克隆了du1基因突变体，解析了其功能和序列变异特征，并根据序列变异关键位点(大片段插入)成功开发了基因功能性kasp检测引物组合。

3、具体地，本发明提供了一种淀粉合酶du1基因自然突变体，其dna序列如seq idno：1-3依次连接所示，还提供了检测dul基因突变体的kasp引物组合du1-kasp，其能在du1du1纯和突变玉米中检测到5839bp(tgttatnaccagt/tgttatnaccagt)插入突变，在du1du1野生型玉米中检测无插入(-/-)，在du1du1杂合型玉米中同时检测到无插入和插入突变(-/tgttatnaccagt)。

4、本发明中tgttat为du1突变型中插入的5839bp的前面6个碱基，accagt为最后6个碱基，其余的中间大片段碱基序列以n代表。

5、本发明在鲜食玉米选育过程中，发现了一种籽粒皱缩且外观明显区别于su1和sh2基因型的甜玉米新类型，命名为xt甜玉米，其成熟自然晾干籽粒含糖量介于普通玉米和su1su1纯合突变甜玉米之间。将xt甜玉米分别与普通玉米自交系京2416和京724正反交后自交来构建4个f2分离群体，4个分离群体的bsr-seq定位将候选基因定位到10号染色体24mb-68 mb(b73 refgen_v3)区间。根据玉米b73参考基因组在该区域内的基因功能注释推测grmzm2g141399(du1)为候选基因，其编码淀粉合成酶ssii。pcr测序分析发现du1突变基因在第三外显子的1455bp后存在5839bp大片段插入，censor软件分析发现该插入序列为gypsy类ltr反转座子。cdna序列分析发现xt甜玉米中du1基因第三外显子中的大片段插入被转录，造成du1基因氨基酸编码异常，是导致xt甜玉米dul基因功能缺失的原因。本发明针对该插入突变，设计kasp引物，开发du1突变位点特异性引物组合du1-kasp，以其对xt甜玉米及其3个选系，4个糯玉米自交系，3份普通玉米自交系以及20份su1su1sh2sh2双基因纯和突变的微胚乳玉米自交系进行基因分型检测，检测结果与预期一致，表明kasp-du1引物组合能够高通量快速鉴别du1突变玉米。

6、具体地，本发明提供如下技术方案：

7、第一方面，本发明提供一种du1基因突变体，其具有如seq id no：1-3依次连接所示的核苷酸序列。

8、本发明的du1基因突变体的核苷酸序列包含17418个碱基，其中的第1-2474bp如seq id no：1所示，第2475-8313bp如seq id no：2所示，第8314-17418bp如seq id no：3所示。

9、第二方面，本发明提供一种du1蛋白突变体，其具有如seq id no：4所示的氨基酸序列。

10、第三方面，本发明提供用于检测du1基因突变体的kasp引物组合，其包括两条特异性引物和两条通用引物，其中，所述特异性引物的序列如seq id no.5-6所示，所述通用引物的序列如seq id no.7-8所示；两条所述特异性引物分别标记有产生不同荧光色的荧光报告基团；du1基因突变体具有如seq idno：1-3依次连接所示的核苷酸序列。

11、所述荧光报告基团为fam、hex、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas中的任一种。

12、du1基因玉米突变体在鲜食玉米品质遗传改良中具有重要的利用价值。由于基因突变与遗传背景的相互作用，有时难以通过籽粒表型来鉴别淀粉合成相关突变基因，尤其是双隐或者多隐突变体的鉴定难度更大，通过分子标记辅助选择可提高品质育种效率。然而，目前尚无可利用的du1突变基因检测引物组合，严重制约了du1玉米种质的鉴别及其在鲜食玉米育种中的应用。缺少高通量快速鉴定du1突变基因的技术方法，不仅制约了du1基因突变玉米种质的筛选鉴定，而且极大增加了du1基因在鲜食玉米改良育种中广泛应用的难度。

13、在设计检测引物时，除了一般引物设计规则外，在突变位点涉及多个缺失或插入的碱基时，当以插入或缺失片段的不同位置碱基作为特异性引物的3’端时，对引物的检测效果影响较大且无一定的规律性。且为了对不同来源玉米材料都能进行检测，引物设计还需考量到不同遗传背景玉米材料的检测需求。这些均给研发出灵敏度高且特异性强的引物组合带来了困难。

14、本发明所开发的du1-kasp能够高通量快速准确鉴定du1du1，du1du1和du1du1不同类型玉米，可通过分子标记辅助育种的方法在du1玉米的鉴别和选育中得到应用，将加速dul突变基因在鲜食玉米品质改良育种中的应用。

15、第四方面，本发明提供用于检测du1基因突变体的检测试剂或试剂盒，其包含上述的kasp引物组合；du1基因突变体具有如seq id no：1-3依次连接所示的核苷酸序列。

16、第五方面，本发明提一种用于检测玉米的方法，其以待测玉米样品的基因组dna为检测模板，利用kasp引物组合进行pcr检测，所述kasp引物组合如上所述；

17、若只检测到如seq id no.5所示特异性引物携带的荧光信号，则判定所述待测玉米样品在du1基因的第2474bp之后含有5839bp的插入突变，待测玉米为du1基因突变型玉米，含糖量高于普通玉米自交系和糯玉米自交系；

18、若只检测到如seq id no.6所示特异性引物携带的荧光信号，则判定所述待测玉米样品在du1基因的第2474bp之后不含有5839bp的插入突变，待测玉米为du1基因野生型玉米；

19、若同时检测到如seq id no.5-6所示特异性引物携带的荧光信号，则判定所述待测玉米样品为du1du1基因杂合型玉米。

20、本发明中，普通玉米指本领域公知的在完熟期收获，主要用作饲料的玉米，其区别于在乳熟期采摘，可鲜食的鲜食玉米(鲜食玉米包括甜玉米、糯玉米和甜加糯玉米)。

21、第六方面，本发明提供du1蛋白突变体或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料、或上述的kasp引物组合、或检测试剂或试剂盒、或方法在鉴别玉米甜度、玉米种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用；所述du1突变体蛋白具有如seq id no：4所示的氨基酸序列。

22、本发明的应用中，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。

23、所述编码基因具有如seq id no：1-3依次连接所示的核苷酸序列。

24、本发明的有益效果在于：

25、本发明提供了一种淀粉合酶du1基因新突变体，其与玉米的甜度相关，能够应用于玉米遗传改良中。本发明还提供了一种能够高通量快速准确鉴定du1du1，du1du1和du1du1不同类型玉米的引物组合。du1-kasp引物组合适于早期快速鉴定，有利于加速du1玉米种质鉴选及其在鲜食玉米品质改良中的应用进程；kasp标记以dna的形式表现，在玉米的各个组织中均存在，取材便利。