一种crRNA转录载体、CRISPR/Cas13d体系和RNA投送体系和应用

本发明属于生物，具体涉及一种广谱靶向多种亚型流感病毒的crrna转录载体、crispr/cas13d体系和rna投送体系和应用。

背景技术：

1、据世界卫生组织统计，流感病毒导致全球每年约290,000-650,000人死亡。当前，h1n1和h3n2亚型流感病毒是季节性流行的主要毒株，此外，由于动物源性流感病毒频繁跨越种间障碍感染人，h5、h7、h9和h10等亚型流感病毒均已在人群中分离到。然而，现有的抗流感药物易诱导病毒耐药性或对机体具有致畸性等副作用。神经氨酸酶抑制剂(扎那米韦和奥司他韦)是目前使用最广泛的抗流感药物，临床研究表明，流感病毒通过突变已经获得了对此类药物的耐药性。近年来上市的抗流感新药rna聚合酶抑制剂(法匹拉韦和巴洛沙韦)也在短时间内致使流感病毒发生耐药突变。因此，亟需研发可有效防止病毒耐药突变的新型广谱抗流感药物。

2、目前的前沿技术已经将着眼点聚焦于核酸疗法，与传统的针对蛋白的治疗策略相比，该疗法由于其靶标为基因从而可以达到显著的疗效，目前应用较多的核酸疗法主要包括dna药物、mrna药物以及sirna药物等，在癌症、病毒感染等疾病治疗中具有极大的潜力。当前大量研究利用crispr/cas技术开发抗病毒新药，例如乙型肝炎病毒(hbv)、人乳头瘤病毒(hpv)、猪流行腹泻病毒(pedv)、艾滋病病毒(hiv)以及sars-cov-2等。同时，纳米递送技术的日渐成熟为核酸疗法的快速发展推波助澜，当前被数以亿计人次接种的mrna新冠疫苗也采用了纳米脂质体递送系统。

3、https：//www.biomart.cn/news/16/2970289.htm记载流感病毒(influenzavirus)基因组由8个线性的负链rna基因组片段组成，全长约13.6kb，分别编码ha、na、m1、m2、pa、pb1、pb2、np、ns1、ns2、pb1-f2等11个已知的病毒蛋白质。其中，血凝素(hemagglutinin，ha)、神经氨酸酶(neuraminidase，na)和离子通道蛋白m2(m2 ionchannel)作为跨膜蛋白位于病毒包膜(envelope)表面；基质蛋白m1(matrix protein)和核蛋白np(nucleoprotein)位于包膜内，m1覆盖在包膜内侧形成基质蛋白层，np包被在病毒rna表面并与m1连接；病毒聚合酶(polymerase)的3个亚单位pa、pb1和pb2形成异聚体后与rna组装成核蛋白复合物(ribonucleoprotein complex，rnp)。非结构蛋白(non-structural protein)nsl、pb1-f2和ns2，又称为核输出蛋白(nuclear export protein，nep)分别起到抑制宿主细胞免疫反应和介导病毒rna输出宿主细胞核的作用。

4、cn114410681公开了一种流感病毒的致弱方法以及致弱流感病毒株和应用，包括以下步骤：删除流感病毒m2部分基因序列，利用反向遗传操作系统，拯救出致弱流感病毒株。所述致弱方法包括以下步骤：制备含删除流感病毒m2部分序列后的核苷酸的缺陷型m质粒；将所述缺陷型m质粒、流感病毒反向遗传的其他7个质粒和表达蛋白的质粒共转染细胞，收获病毒，得到致弱流感病毒株；所述反向遗传的其他7个质粒包括表达以下基因组片段的双向表达质粒：pb2、pb1、pa、np、ns、ha和na；所述表达蛋白的质粒包括表达pr8-m2蛋白的质粒。

5、cn114480303a公开了一种致弱毒株的构建方法，包括以下步骤：

6、构建含修饰后m2基因的质粒，获得缺陷型m2-2×stop+del质粒；

7、利用反向遗传系统，将表达流感病毒基因组片段和蛋白的质粒混合后转染细胞，收获病毒，得到a型流感病毒致弱毒株；

8、所述质粒包括缺陷型m2-2×stop+del质粒、pb2质粒、pb1质粒、pa质粒、np质粒、ns质粒、ha质粒和na质粒；

9、所述质粒还包括表达pr8-m2蛋白的质粒。

10、cn112680477b公开了一种基于无缝克隆技术的h9n2亚型禽流感病毒的拯救方法，包括如下步骤：步骤1：提取h9n2亚型禽流感病毒的rna，并根据rna获得病毒的cdna；步骤2：以cdna为模板采用8对引物扩增得到h9n2亚型禽流感病毒8个片段的pcr产物；步骤3：将phw2000质粒进行酶切得到线性化片段；步骤4：将h9n2亚型禽流感病毒8个片段的pcr产物分别与线性化的phw2000载体进行同源重组得到8种重组质粒；步骤5：将8种重组质粒共同转染293t及mdck混合培养细胞，得到重组的h9n2病毒；

11、8种片段分别为ha基因、na基因、np基因、pb1基因、pb2基因、pa基因、m基因、ns基因。

12、cn110628819a公开了一种构建h13n2亚型流感病毒反向遗传操作系统的方法及其应用。所述构建方法包括：将h13n2亚型流感病毒内部8个基因pb2、pb1、pa、ha、np、na、m和ns共同导入宿主细胞，培养，即获得重组病毒。

13、通过以上记载可见，现有的流感的预防疫苗大多采用重组病毒的方式得到。

14、通过重组病毒的方式的劣势在于：通过重组病毒得到减毒毒株并用于流感疫苗的抗流感效果取决于疫苗株与当前流行毒株之间的匹配程度，而流感流行株的快速变异也致使疫苗通常无法有效地发挥保护作用，并且当应对新突变流感毒株时，研发适配疫苗所需周期长，无法及时应对流感流行。

15、关于脂质体的检索大致可参考如下专利：

16、cn2023100109516公开了一种用于递送核酸的可电离阳离子脂质化合物和组合物及用途；

17、其说明书记载：

18、一种组合物，其包含载体，所述载体包括阳离子脂质，所述阳离子脂质包括根据前述权利要求中任一项所述的的式(i)化合物或其n-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体；

19、所述阳离子脂质占载体的摩尔比为25％～75％；

20、所述载体还包含中性脂质；

21、其中所述阳离子脂质与所述中性脂质的摩尔比为1：1～15：1，优选为4.5：1。

22、其中所述中性脂质包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、神经酰胺、甾醇及其衍生物中的一种或多种。

23、其中所述中性脂质选自以下中的一种或多种：1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dlpc)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(dmpc)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)、1，2-双十-烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(dupc)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(popc)、1，2-二-o-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18：0dietherpc)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(ochemspc)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(c16lyso pc)、1，2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(me 16.0pe)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(dopg)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(dppg)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(pope)、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺(dspe)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(dmpe)、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺(sope)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱(sopc)、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺(lpe)以及其混合物。

24、其中所述中性脂质是dope和/或dspc。

25、其中所述载体还包含结构性脂质。

26、其中所述阳离子脂质与所述结构性脂质的摩尔比为0.6：1～3：1。

27、其中所述结构性脂质选自以下中的一种或多种：胆固醇、非甾醇、谷固醇、麦角固醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、番茄碱、番茄碱、熊果酸、α-生育酚、皮质类固醇。

28、其中所述结构性脂质是胆固醇。

29、其中所述载体还包含括聚合物共轭脂质。

30、其中所述聚合物共轭脂质占载体的摩尔比为0.5％～10％，优选为1.5％。

31、其中所述聚合物共轭脂质选自以下中的一种或多种：peg修饰的磷脂酰乙醇胺、peg修饰的磷脂酸、peg修饰的神经酰胺、peg修饰的二烷基胺、peg修饰的二酰基甘油、peg修饰的二烷基甘油。

32、其中所述聚合物共轭脂质选自以下中的一种或多种：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇2000(dspe-peg2000)，二肉豆蔻酰甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(dmg-peg2000)和甲氧基聚乙二醇双十四烷基乙酰胺(alc-0159)。

33、其中所述载体包括中性脂质、结构脂质以及聚合物共轭脂质，所述阳离子脂质、所述中性脂质、所述结构脂质、以及所述聚合物共轭脂质的摩尔比为(25～75)：(5～25)：(15～65)：(0.5～10)。

34、cn202210003912.9公开了将rna递送至靶组织的rna lipoplex颗粒的方法，以及包含这样的rna lipoplex颗粒的组合物。其说明书记载：其中所述脂质体的平均直径为至少约250nm。

35、cn111840229a公开了一种抑制氨基酸合成的声动力线粒体靶向纳米脂质体制备方法，涉及药物化学的合成领域，更具体地涉及从合成线粒体靶向磷脂、合成载药脂质体等各步的具体方法。抑制氨基酸合成的声动力线粒体靶向纳米脂质体制备方法具体包括以下步骤：(1)利用酰胺反应合成线粒体靶向磷脂(2)利用薄膜超声法合成抑制氨基酸合成的声动力线粒体靶向纳米脂质体。

36、可见靶向磷脂在脂质体中的应用已经被本领域技术人员采用。

37、在本发明的研究中，我们发现脂质体的包覆效率、靶向效果不仅仅和包裹的rna密切相关，其和脂质体的组成也密切相关。

38、综上所述，要实现广谱抗流感现实情况具有两大制约因素：

39、1.如何构建具有广谱抗流感的rna；

40、2.如何将rna高效的递送到细胞内。

41、本案首先要解决的技术问题为：如何构建具有广谱抗流感的rna。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种crrna转录载体，该crrna转录载体可转换得到crispr-cas13d的crrna，其和cas13d mrna配合，可达到广谱抗流感病毒的效果；

2、具体来说，crispr-cas13d系统可以同时靶向流感病毒pa、np、m基因，多靶点组合可以有效阻止流感病毒发生耐药突变。

3、对于流感病毒来说，ha、na、m1、m2、pa、pb1、pb2、np、ns1、ns2、pb1-f2等11个已知的病毒蛋白质中，我们经过分析后认为：以ha、na基因为例，这类病毒表面基因，很容易突变，同时，寻找这类基因的保守区有效的crrna也会非常困难，从广谱抗病毒性的角度来说，经过前期实验，排除了此类基因进入后续筛选的可能性；

4、经过反复筛选后，我们确定了pa基因、np基因、m基因是最佳候选对象；同时也发现，在这三个基因中寻找保守区有效的crrna会更为可靠和有效；

5、经过上述工作后，还需要进行不同病毒的pa基因、np基因、m基因的筛选，寻求最佳的组合；crrna中所具有的靶向pa、np、m基因的序列是经过反复筛选，从2018年至2022年所有感染人类的h1n1、h3n2、h5nx、h7n9亚型流感病毒以及2018年至2022年所有的h9n2亚型流感病毒的pa、np、m的mrna序列中筛选得到3个靶向pa基因、np基因、m基因的序列并将其设计为crrna；并将其连接到载体上之后发现，其表现出非常优异的抗病毒效果。

6、上述的crrna采用pa基因、np基因、m基因可基本覆盖现有流行的流感病毒，具有广谱性和有效性。

7、同时，本发明还公开了一种crispr/cas13d体系和rna投送体系和应用；

8、本发明采用crispr/cas13d体系的优势在于：传统抗病毒治疗由于其目标是蛋白质而不是病毒基因组，效果通常是短暂的，相比之下，通过crispr/cas技术直接抑制病毒基因组，可以达到快速并显著的疗效；通过crispr/cas技术结合特别筛选的crrna，其具有作用对象直接、广谱性优异、见效快等优势；

9、该rna投送体系特别适用于本发明的crispr/cas13d体系，其rna搭载浓度高、包覆效果好、靶向性优异，具有极佳的溶酶体逃逸能力。

10、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：一种crrna转录载体，其核苷酸序列如seq id no.2所示。

11、同时，本发明还公开了一种crispr/cas13d体系，包括cas13d mrna和crrna；包括cas13d mrna和crrna；

12、cas13d mrna的核苷酸序列如seq id no.4所示；crrna的核苷酸序列如seq idno.81、seq id no.82或seq id no.84所示。

13、优选地crrna的核苷酸序列如seq id no.81所示。

14、所述cas13d mrna的制备方法为：

15、以cas13d表达质粒为模板，对cas13d表达质粒进行线性化处理；所述cas13d表达质粒的核苷酸序列如seq id no.4所示；

16、对线性化处理后的cas13d表达质粒进行回收与纯化得到第一dna片段；

17、对第一dna片段进行体外转录和纯化，得到第一rna；

18、对第一rna进行加帽处理和加尾处理得到cas13d mrna；

19、所述crrna的制备方法为：

20、以crrna转录载体为模板，对crrna转录载体进行线性化处理；所述crrna转录载体的核苷酸序列如seq id no.2所示；

21、对线性化处理后的crrna转录载体进行回收与纯化得到第二dna片段；

22、对第二dna片段进行体外转录和纯化，得到第二rna；

23、对第二rna进行加帽处理和加尾处理得到crrna。

24、在上述的crispr/cas13d体系中，所述cas13d mrna和crrna的摩尔比例为1：1。

25、同时，本发明还公开了一种rna投送体系，包括脂质体和包裹在脂质体内的crispr/cas13d体系；所述crispr/cas13d体系如上所述；

26、所述脂质体的壳材包括如下重量份成分：

27、dopc 7.6份；

28、dotap 0.2份；

29、胆固醇0.5份；

30、dspe-peg20000.32份；

31、dspe-peg3600-gala 0.08份。

32、dspe-peg3600-gala的化学名称为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3600-gala，gala多肽连接在聚乙二醇3600上，该物质委托西安瑞禧生物合成。gala为多肽，其氨基酸序列为weaalaealaealaehlaealaealealaa；gala为本领域常用的肺靶向多肽。

33、在上述的rna投送体系中，所述脂质体的直径为100nm。

34、最后，本发明还公开了如上所述的rna投送体系作为抗流感药物的活性成分的用途。

35、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

36、本发明的crrna转录载体可转换得到crispr-cas13d的crrna，其和cas13d mrna配合，可达到广谱抗流感病毒的效果；

37、本发明中的crispr-cas13d系统可以同时靶向流感病毒pa、np、m基因，多靶点组合可以有效阻止流感病毒发生耐药突变。

38、crrna中所具有的靶向pa、np、m基因的序列是经过反复筛选，从2018年至2022年所有感染人类的h1n1、h3n2、h5nx、h7n9亚型流感病毒以及2018年至2022年所有的h9n2亚型流感病毒的pa、np、m的mrna序列中筛选得到3个靶向pa基因、np基因、m基因的序列，并将其设计为crrna；并将其连接到载体上之后发现，其表现出非常优异的抗病毒效果。

39、同时，本发明还公开了一种crispr/cas13d体系和rna投送体系和应用；

40、该rna投送体系特别适用于本发明的crispr/cas13d体系，其rna搭载浓度高、包覆效果好、靶向性优异，具有极佳的溶酶体逃逸能力。