一种TK缺失的牛结节性皮肤病病毒及其应用

本发明涉及病毒疫苗及疫苗制备领域，具体涉及牛结节性皮肤病病毒疫苗。

背景技术：

1、牛结节性皮肤病(lumpy skin disease，lsd)是一种由牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus，lsdv)引起牛的一种的高度传染性疫病。临床表现症状为，发热到40～41.5℃，并持续1～3d，体重减轻，产奶量减少，严重的会停止产奶；还会出现流涎、流泪，伴有流脓性或粘脓性鼻涕；全身淋巴结体积增大，形成单个或多个圆形皮肤结节，多出现在头部、颈部、背部、乳房、会阴、生殖器、四肢、尾巴等毛发稀疏区域。皮肤结节溃烂会招引蝇蛆而引起细菌感染，伤口数月无法愈合，最后留下可深入到肌肉组织的永久性痘疤，严重降低皮革制品的质量。虽然lsd发病率差异很大(5％～90％)，死亡率较低(10％以下)，但在个别疫情区域中可达到85％，偶发性或者巨大差异的死亡率可能与牛品种、毒株毒力、动物健康状态以及传播媒介类型等密切相关。lsd给疫情国家的养牛业造成重大经济损失，该病被世界动物卫生组织列为必须报告的疫病之一。

2、牛结节性皮肤病病毒属于痘病毒科(poxviridae)，脊椎动物痘病毒亚科(chordopoxvirinae)，羊痘病毒属(capripoxvirus)。该病毒属于双链dna病毒，基因组全长约150kbp，编码约156个假定基因，lsdv粒子呈砖型，长294±20nm，宽262nm±22nm。投射电子显微镜下，羊痘病毒基因组呈现三折叠螺旋状或管状，且基因组组成了双凹核心的结构，该核心和两个侧体被衣壳包围。与其它痘病毒基因组一样，两末端是发卡结构，这样的发卡结构与复制密切相关，紧邻发卡结构的两末端是反向重复序列(itr)。tk已经在dna病毒中被证明是复制非必须的毒力基因，当其被缺失后病毒毒力会降低(tenserrb,1991；martínhernándezam etal，1995)，但是抗原性不受影响(刘正飞等，2002)。lsdv tk(thymidinekinase)基因全长534bp，编码178个基酸，对lsdv毒力同样有着重要影响(wallace db,viljoen gj，2022)。

3、自2019年lsd传入我国以来，该病已经迅速在我国各省市传播开来，给养殖业带来巨大经济损失。目前没有特效药物可以治疗牛结节性皮肤病。一般用弱毒活疫苗(lav)用于预防lsd；第一类为基于lsdv毒株的弱毒同源疫苗，包括neethling株疫苗和kgsp株疫苗；第二类为非lsdv毒株弱毒异源疫苗，如山羊痘疫苗和和绵羊痘疫苗。南非地区主要以弱毒同源疫苗(neethling/vaccine/lw1959)来控制该病，且已有多种衍生疫苗，如lumpyvax、herbivac ls和obp等疫苗。尽管弱毒同源疫苗通过连续传代致弱，但在使用neethling疫苗时，牛会产生副作用。常见的副作用表现为接种部位的局部反应、短暂的发烧和产奶量下降，有些动物可能会表现出温和的全身性反应。因此，尽快研发一款或者几款安全、有效的lsd治疗药物或疫苗对养牛产业意义重大。

技术实现思路

1、第一方面，本发明提供一种基因缺失的牛结节性皮肤病病毒毒株lsdvδtk，保藏日期：2023.3.10，保藏编号：cctcc no:v202314，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心。

2、进一步的，所述基因缺失是tk基因(thymidine kinase)的缺失。

3、进一步的，所述牛结节性皮肤病病毒毒株lsdv优选neethling疫苗毒株。

4、进一步的，所述基因缺失的牛结节性皮肤病病毒毒株lsdvδtk的δtk的序列如下：

5、seq id no:1

6、atgctatgaatatatacatttaattataggacctatgttttctggcaaaagtactgaattgataagaatagttaaaaggt

7、accaaatagcgcagtataaatgctgtgtagtaaaatacttaaaagatatccgatatggtaattctgtgtatacgcatgat

8、aataaccatgtatctgccatatcaacaactttattatatgacgtcgttgataaaattatgaattacattataggtataga

9、tgaaggccaattctttaaagatattgtatctttttctgaaaatacggcaaatatgggaaagataattataatagctgcac

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12、taaggaaaaatataaatctgtttgtaggaaatgttatttttgagaataa。

13、第二方面，本发明提供一种获得基因缺失牛结节性皮肤病病毒毒株lsdvδtk的方法；所述方法包括如下步骤：

14、s01构建δtk的lsdv细胞系；

15、s02在上述δtk的lsdv细胞培养过程中，通过药物筛选lsdvδtk突变株。

16、进一步的，所述细胞优选vero tk-细胞，将vero tk-细胞接种在含有brdu的dmem培养液中，待长满后，以5个moi感染vero tk-细胞，继续在含有brdu的dmem培养液继续培养。

17、进一步的，所述药物为5-溴脱氧尿嘧啶核苷(brdu)溶液，所述溶液浓度为10-50mg/l。

18、第三方面，本发明提供一种含有基因缺失的牛结节性皮肤病病毒毒株lsdvδtk的药物组合物，所述药物组合物可以是疫苗、免疫制剂和/或免疫佐剂的组合。

19、进一步，所述基因缺失的牛结节性皮肤病病毒毒株lsdvδtk可以是病毒核酸或蛋白质。

20、第四方面，本发明提供一种基因缺失的牛结节性皮肤病病毒毒株lsdvδtk在制备牛结节性皮肤病免疫药物中的应用。

21、进一步的，所述免疫药物可以是疫苗、免疫制剂和/或免疫佐剂。

22、进一步的，所述疫苗优选活疫苗或灭活疫苗。

23、进一步的，所述免疫制剂和/或免疫佐剂是含有表达基因缺失的牛结节性皮肤病病毒毒株lsdvδtk的核酸或蛋白质。

24、进一步的，所述免疫药物给药途径选自：经口给药、舌下给药、胃或肠给药、局部给药、注射给药、静脉注射、皮下注射、肌肉注射、经皮给药、和/或吸入给药等。

25、进一步的，所述免疫药物其剂型可以为：片剂胶囊剂、粉剂、注射剂、糖浆剂、溶液剂、缓释剂、速释剂、控释剂、乳剂、微乳剂、纳米制剂、靶向制剂、栓剂、膏剂、凝胶剂、固体分散体、包合物和/或贴剂。

26、第五方面，本发明提供一种病毒载体及其组合物，所述病毒为基因缺失的牛结节性皮肤病病毒毒株lsdvδtk，capripoxvirus lumpy skin disease virus lsdvδtk(n))；保藏日期：2023.3.10；保藏编号：cctcc no:v202314，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心。

27、atgctatgaatatatacatttaattataggacctatgttttctggcaaaagtactgaattgataagaatagttaaaaggt

28、accaaatagcgcagtataaatgctgtgtagtaaaatacttaaaagatatccgatatggtaattctgtgtatacgcatgat

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33、taaggaaaaatataaatctgtttgtaggaaatgttatttttgagaataa。

34、进一步的，所述组合物为基因缺失的牛结节性皮肤病病毒毒株lsdvδtk载体负载异源和/或同源基因组成的组合物。

35、有益效果：

36、通过药物5-溴脱氧尿嘧啶核苷(brdu)构建和筛选得到的牛结节性皮肤病病毒毒株lsdvδtk突变株，作为注射疫苗，在牛体上可产生良好的中和抗体反应，没有副反应，安全性高，为畜牧业牛的养殖降低了养殖成本，提高了经济效益。