一种重楼芜菁花叶病毒的检测引物，检测试剂盒及检测方法

本发明属于植物病毒检测，具体涉及一种重楼芜菁花叶病毒的检测引物，检测试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、芜菁花叶病毒(turnip mosaic virus，tumv)属于马铃薯y病毒科(potyviridae)马铃薯y病毒属(potyvirus)，是马铃薯y病毒科危害范围最广、危害程度最大的病毒，它能够侵染43个科156个属318种植物，是严重危害蔬菜作物的第2大植物病毒。课题组通过对重楼感病植株进行转录组、病毒组大数据分析以及病毒全基因组序列的分离鉴定，首次明确了tumv是感染重楼植株、并引起严重病害的罪魁祸首之一。在重楼感染tumv初期，植株病症极不明显，使其难以被及时发现，进而错过了最佳防治时期；而随着病症程度的逐渐加深，叶片会逐渐呈现不均匀褪绿、花叶，并引起植株生长缓慢，品质衰退，抗病和抗性能力大幅减弱，最终导致整个植株枯死。而且在自然条件下，由于感病植株往往还会作为病源，继续通过病叶与健康叶之间的机械摩擦、蚜虫和蓟马等其它害虫的咬食携带进一步传播感染周围的健康植株，从而爆发大面积的病毒感染，目前已成为重楼规模化种植的严重威胁。另外，由于重楼种子自然萌发率低、成苗率低等原因，种植户普遍以根茎切断无性繁殖的方式进行种植，也进一步增加了病毒传播和感染的风险。因此如何实现重楼tumv病情的早发现、早防治，已成为了控制其危害，保障重楼品质与产量和种植户经济效益的主要问题之一。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了提供一种重楼芜菁花叶病毒的检测引物，检测试剂盒和检测方法，以实现对重楼tumv感病植株的及早发现，并为后续重楼tumv病毒的早期防治奠定基础。

2、为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

3、本发明提供了一种重楼芜菁花叶病毒的检测引物，包含以下三对引物：

4、tumv-p5-f，序列为seq id no：14，tumv-p5-r，序列为seq id no：15；

5、tumv-p6-f，序列为seq id no：17，tumv-p6-r，序列为seq id no：18；

6、tumv-p7-f，序列为seq id no：20，tumv-p7-r，序列为seq id no：21。

7、优选的，三对引物根据重楼芜菁花叶病毒全基因组序列设计。

8、本发明还提供了一种重楼芜菁花叶病毒的检测试剂盒，其含有上述三对检测引物任一对。

9、优选的，检测试剂盒还包含2×taq pcr starmix，阳性对照，阴性对照。

10、进一步优选的，阳性对照为重楼芜菁花叶病毒的cdna模板序列，阴性对照为不含cdna的pcr扩增体系。

11、本发明还提供一种重楼芜菁花叶病毒的检测方法，具体包括以下步骤：

12、(1)样品及模板的获得：利用rna提取试剂盒提取待测样品的rna，然后逆转录得到cdna；

13、(2)pcr扩增：利用上述检测引物或上述检测试剂盒进行pcr扩增，pcr扩增程序为94-96℃2-5min；94-96℃10-20s，55-57℃10-20s，71-73℃20-40s，35个循环；71-73℃4-6min，4℃保存；

14、(3)结果判读：将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，成像后判读结果，出现明亮清晰的相应大小的特异性条带时表明重楼样品感染了芜菁花叶病毒；没有出现特异性条带是表明重楼样品未感染芜菁花叶病毒。

15、优选的，步骤(1)中的待测样品为单株重楼植株或多株重楼植株。

16、优选的，步骤(1)中的逆转录所用的引物为通用引物、随机引物或芜菁花叶病毒逆转录特异性引物中任一种。

17、优选的，芜菁花叶病毒逆转录特异性引物为tumv-gsp-adaptor，序列为seq idno：1。

18、本发明的有益效果在于：根据重楼芜菁花叶病毒的基因组序列设计得到了一个可特异性的将tumv逆转录合成cdna的逆转录引物tumv-gsp-adaptor，该引物可以增加tumv逆转录产物的产量，增强了后续实验的灵敏性，降低了非特异性扩增的风险。还根据重楼芜菁花叶病毒的基因组序列设计得到了三对可特异性扩增tumv片段的pcr引物对：tumv-p5-f和tumv-p5-r，tumv-p6-f和tumv-p6-r以及tumv-p7-f和tumv-p7-r；利用这三对引物可以简单快速且准确的鉴定重楼植株是否感染了芜菁花叶病毒，实现对重楼芜菁花叶病毒的早期发现与及时防治，降低该病毒对重楼的危害，避免造成大规模的减产。此外通过设计筛选得到的tumv检测引物，制备了一种重楼芜菁花叶病毒的检测试剂盒，该试剂盒不仅可以对单个重楼植株样本进行检测，还可以对多个重楼植株的混合样本进行检测，加快了检测速度，降低了检测成本。

技术特征：

1.一种重楼芜菁花叶病毒的检测引物，其特征在于：包含以下三对引物：

2.根据权利要求1所述的一种重楼芜菁花叶病毒的检测引物，其特征在于：所述三对引物根据重楼芜菁花叶病毒全基因组序列设计。

3.一种重楼芜菁花叶病毒的检测试剂盒，其特征在于：含有权利要求1或2所述的检测引物任意一对。

4.根据权利要求3所述的一种重楼芜菁花叶病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒还包含2×taq pcr starmix，阳性对照，阴性对照。

5.根据权利要求4所述的一种重楼芜菁花叶病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为重楼芜菁花叶病毒的cdna模板序列，阴性对照为不含cdna的pcr扩增体系。

6.一种重楼芜菁花叶病毒的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的一种重楼芜菁花叶病毒的检测方法，其特征在于：步骤（1）所述的待测样品为单株重楼植株或多株重楼植株。

8.根据权利要求6所述的一种重楼芜菁花叶病毒的检测方法，其特征在于：步骤（1）所述的逆转录的引物为通用引物、随机引物或芜菁花叶病毒逆转录特异性引物中任一种。

9.根据权利要求8所述的一种重楼芜菁花叶病毒的检测方法，其特征在于：所述芜菁花叶病毒逆转录特异性引物为tumv-gsp-adaptor，序列为seq id no：1。

10.根据权利要求6所述的一种重楼芜菁花叶病毒的检测方法，其特征在于：步骤（2）所述的pcr扩增程序为94-96℃ 2-5min；94-96℃ 10-20s，55-57℃ 10-20s，71-73℃ 20-40s，35个循环；71-73℃ 4-6min，4℃保存。

技术总结
本发明公开了一种重楼芜菁花叶病毒的检测引物，试剂盒及检测方法，属于植物病毒检测领域。本发明提供了三对能够特异性扩增重楼芜菁花叶病毒的检测引物对，同时利用这些引物对制备得到了一种检测试剂盒，可以快速准确的检测重楼是否感染了TuMV病毒；此外开发了一种与检测试剂盒相配的检测方法，该方法可以通过PCR凝胶电泳结果判断出重楼的病毒感染情况，具有快速、准确的优点。本发明得到的检测引物、检测试剂盒以及检测方法不仅可以对单一的重楼植株样本进行检测，还可以进行多样品的混检，有利于及早发现重楼植株感染TuMV的病情，为后续的及时防治争取宝贵时间，避免了TuMV病害的大规模爆发带来的经济损失。

技术研发人员：马江,张静,高倩倩,杜博文,朱惠贤
受保护的技术使用者：三峡大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15