一种解脂耶氏酵母工程菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种解脂耶氏酵母工程菌及其应用，属于微生物。

背景技术：

1、虾青素是自然界中抗氧化活性最强的脂溶性类胡萝卜素化合物，通常存在于各种海洋细菌、藻类和水生动物中。虾青素能够保护细胞、脂质和膜脂蛋白免受氧化损伤；虾青素还具有抗衰老、抗炎、抗癌、抑制幽门螺旋杆菌感染、激活免疫应答、改善记忆力等特性，已经被广泛的应用于食品、药品、保健品、化妆品和饲料等领域，其全球年需求量已经达到250吨，销售额接近4.5亿美元，到2025年有望达到25亿美元，具有极高的经济与应用价值。

2、目前，市场上所使用的虾青素大部分是通过化学合成或者从藻类中提取获得。化学合成虾青素由于其立体异构体的缘故，无法被人体吸收利用，只能用于动物和水产养殖着色。虽然有多种生物富含虾青素，直接提取普遍存在生产效率低、不具有经济优势。现有技术中常用改造雨生红球藻进行虾青素的生产，但是因培养期长，提取过程复杂，不适于工业生产。

3、近年来，利用合成生物学方法通过工程化改造微生物底盘细胞，并加载目标优化的异源产物合成路径构建人工细胞工厂从而获得虾青素，已经引起国际研究者的普遍关注，并逐渐发展为替代化学合成和天然提取的有效方法。现有文献和专利中通过引入虾青素的异源途径实现了虾青素在微生物中的合成，宿主主要为大肠杆菌、酿酒酵母、红法夫酵母等，但这些工程菌仍然存在虾青素产量较低的问题。另外，大肠杆菌存在内毒素引起的安全性问题，不足以应用于工业化生产。

4、解脂耶氏酵母含有丰富的合成类胡萝卜素化合物前体原料乙酰辅酶a，且其细胞内积累有大量的脂质且不产生内毒素，这些特性使解脂耶氏酵母成为生物合成虾青素的优良底盘菌。因此，开发高产虾青素的解脂耶氏酵母工程菌具有重要的应用价值。目前，已有一些专利和文献通过在解脂耶氏酵母中引入异源途径基因实现了虾青素的从头合成，主要是过量表达代谢途径中的相关基因，但是外源基因引入对细胞生长造成代谢负担、增加对氧需求、菌株易变丝状形态、产物反馈抑制等问题，造成解脂耶氏酵母工程菌产量较低。解决解脂耶氏酵母工程菌发酵生产过程中虾青素和代谢中间产物累积抑制菌株代谢和生长的难题，对提高虾青素生产效率具有重要意义的。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种解脂耶氏酵母工程菌zmw1378，该工程菌株能够用于以葡萄糖为底物高效合成虾青素，合成的虾青素产量高、纯度高。

2、本发明的技术方案如下：

3、本发明的目的之一在于提供一种解脂耶氏酵母工程菌zmw1378，保藏编号为cctccno：m 2023294的解脂耶氏酵母工程菌zmw1378，本发明的解脂耶氏酵母工程菌zmw1378的保藏信息如下：

4、菌种名称：解脂耶氏酵母

5、拉丁名：yarrowia lipolytica

6、菌株编号：zmx1378

7、保藏机构：中国典型培养物保藏中心

8、保藏机构简称：cctcc

9、地址：中国武汉武汉大学

10、保藏日期：2023年3月13日；

11、其中，所述解脂耶氏酵母工程菌zmw1378基因组整合了

12、crtyb-crti-dag1-vhb基因簇和bscrtw-pacrtz突变基因簇。

13、进一步的，所述解脂耶氏酵母工程菌zmw1378基因组过表达crtyb基因和crti基因，crtyb基因和crti基因来源于红法夫酵母xanthophyllomyces dendrorhous，crtyb基因表达八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶，如seq id no.1所示，crti基因表达八氢番茄红素去饱和酶，如seq id no.2所示。

14、进一步的，所述解脂耶氏酵母工程菌zmw1378基因组过表达dag1基因，dag1基因来源于解脂耶氏酵母yarrowia lipolytica，表达二酰基甘油酰基转移酶，如seq id no.3所示。

15、进一步的，所述解脂耶氏酵母工程菌zmw1378基因组过表达vhb基因，vhb基因来源于透明颤菌vitreoscilla，表达血红蛋白如seq id no.4所示。

16、进一步的，所述解脂耶氏酵母工程菌zmw1378基因组过表达bscrtw突变基因，bscrtw突变基因来源于海洋短波单孢菌brevundimonas sp.，表达β-胡萝卜素酮化酶，如seq id no.5所示，其第12位的a突变成c，241位的g突变成a，485位的g突变成t。

17、进一步的，所述解脂耶氏酵母工程菌zmw1378基因组过表达pacrtz突变基因，pacrtz突变基因来源于菠萝泛菌pantoea ananatis，表达β-胡萝卜素羟化酶，如seq idno.6所示，其第147位的a突变成c，392位的g突变成a。

18、进一步的，所述解脂耶氏酵母工程菌zmw1378基因组上敲除甘油-3-磷酸脱氢酶gut2位点。

19、本发明的目的之二在于提供一种生物合成虾青素的解脂耶氏酵母工程菌zmw1378的构建方法，包括如下步骤：

20、(1)将crtyb-crti-dag1-vhb基因簇通过多拷贝质粒pina1312导入解脂耶氏酵母基盘菌株，筛选得到合成虾青素前体β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母工程菌zm072；

21、(2)经过基因重组方式敲除zm072基因组上的甘油-3-磷酸脱氢酶gut2基因，得到解脂耶氏酵母工程菌zm072(△gut2)；

22、(3)对bscrtw-pacrtz基因簇进行协同定向进化改造，将bscrtw-pacrtz基因簇的突变库基因通过单拷贝质粒pina1269导入所述解脂耶氏酵母菌株zm072(△gut2)，经高通量筛选得到高效合成虾青素的解脂耶氏酵母工程菌zmx1378。

23、其中，所述解脂耶氏酵母基盘菌可为解脂耶氏酵母atcc may-2613。

24、本发明的目的之三在于将所述的解脂耶氏酵母工程菌zmw1378以葡萄糖为底物合成虾青素。

25、本发明的目的之四在于提供一种解脂耶氏酵母工程菌zmw1378以葡萄糖为底物合成虾青素的方法，培养解脂耶氏酵母工程菌zmw1378，获得种子液；再将种子液接种到发酵培养基中，进行葡萄糖反馈补料发酵，发酵过程的ph控制在5.6-6.0，发酵过程的温度为28-30℃，发酵时间优选96-128h；葡萄糖反馈补料控制其浓度在0.2-2g/l，通过葡萄糖反馈补料发酵获得虾青素。

26、相较于现有技术，本发明的有益效果在于：

27、(1)本发明在解脂耶氏酵母基盘菌中引入虾青素合成代谢关键酶基因crtyb、crti的基础上，利用体外定向改造技术，将虾青素合成代谢途径上的关键基因簇bscrtw-pacrtz当做一个整体同时进行定向改造突变，优化外源引入关键基因bscrtw和pacrtz的表达水平和酶活比例，优化虾青素代谢流降低菌株代谢负担，经高通量筛选获得高产虾青素优良菌种zmx1378，有效提高虾青素的合成效率；

28、(2)本发明在解脂耶氏酵母工程菌中引入优选虾青素合成模块基因的基础上，引入透明颤菌血红蛋白vhb基因，提高菌株的氧利用率和虾青素合成代谢关键酶的表达效率，降低能耗和生产成本；

29、(3)本发明在解脂耶氏酵母工程菌中引入虾青素优选合成模块基因和血红蛋白基因的基础上，过表达解脂耶氏酵母二酰基甘油酰基转移酶dag1基因，敲除了工程菌基因组上调控脂质体降解的甘油-3-磷酸脱氢酶gut2基因，提高工程菌的脂质含量，增加虾青素的储存空间，从而提高工程菌虾青素生产能力。

30、(4)利用本发明提供的解脂耶氏酵母工程菌zmw1378可以用于发酵生产虾青素，其发酵液中虾青素的产量在30吨发酵规模达到3237.2mg/l，具有很高的产业化应用价值。