一种利用阳离子-非离子共聚物促进木质纤维素酶解的方法

本发明涉及木质纤维素酶解，特别涉及一种利用阳离子-非离子共聚物促进木质纤维素酶解的方法。

背景技术：

1、随着石油资源的短缺以及人们对能源、环境问题重视程度的日益提高，发展清洁和可再生能源来取代化石资源迫在眉睫。利用木质纤维素生物质为原料，转化为清洁、可再生能源，己成为当今的科学研究热点，也是缓解能源危机与环境污染的有效途径之一。其中，纤维素乙醇被认为是最具吸引力的产品之一。木质纤维素生物质主要通过三个步骤转化为生物乙醇，即(1)预处理破坏木质纤维素的生物顽抗性；(2)酶促糖化从结构性聚糖中释放可发酵单糖；以及(3)微生物发酵产生纤维素乙醇。其中，酶促糖化是碳水化合物转化为可发酵糖的限速步骤。

2、纤维素酶是酶促糖化的关键生物催化剂，而因其活性低，耗量大，价格高，且容易吸附在木质素上产生无效吸附使得酶解效率较低等特点，导致酶解糖化成本较高，直接阻碍了纤维素乙醇的工业化。根据美国国家可再生能源实验室(nrel)最近的成本评估报告，玉米秸秆生产1加仑乙醇的总成本为2.15美元，其中就有16.7％来自酶成本(0.36美元/加仑乙醇)。因此，开发新技术以提高木质纤维素酶解糖化效率尤其重要。研究者们通过在酶解体系中加入可促进酶解的助剂，如表面活性剂以及牛血清白蛋白等，其能够降低木质素对酶的无效吸附，提高木质纤维素的酶解效果，从而减少纤维素酶用量。

3、xu等(bioresourtechnol,2021,337,125341)研究发现当在0.2m醋酸-醋酸钠缓冲液(ph 4.8)，纤维素酶的添加量为10fpu/g干生物质(dm)条件下酶解，底物含量为2％、5％、10％、15％、20％时，在反应体系中添加大豆磷脂(25mg/g dm)后，葡萄糖产量分别提高了2.8％、6.3％、8.4％、12.1％和17.8％；添加乳清蛋白(25mg/g dm)后，葡萄糖产量分别提高了1.2％、4.4％、5.5％、8.5％和11.9％。pallapolu等(ind.eng.chem.res.2020,59,5186-5193)研究了不同的水溶性聚合物，包括聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和聚乙烯亚胺，用含木质素的底物和无木质素的底物用于酶解试验。研究发现，添加10mg聚合物/g底物最高可使得葡聚糖水解率从52.3％增加到87.7％。其中，非离子聚合物(pvp、pva和peg)对所有底物的产率均显著高于离子聚合物(pei)。

4、综上所述，助剂的添加可以强化木质纤维素的酶解，从而减少纤维素酶用量，降低酶解成本。但是上述助剂对酶解强化效果不佳，其中离子聚合物更是使纤维素酶活力发生了较大的损失。因此，探究一种对纤维素酶催化活性无影响，合成方法简单，并且能够明显强化木质纤维素酶解的助剂具有重大的意义。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的缺点和不足之处，本发明提供了一种利用阳离子-非离子共聚物促进木质纤维素酶解的方法。

2、本发明将阳离子和非离子单体共聚反应，并调节两种单体的摩尔比得到具有适当数量正电荷的共聚物，不仅合成方法简单，产品得率高，而且合成的产品可以有效保留纤维素酶的催化活性，可以高效地强化木质纤维素酶解。

3、本发明的目的通过下述方案实现：

4、一种利用阳离子-非离子共聚物促进木质纤维素酶解的方法，该方法将阳离子-非离子共聚物加入到以木质纤维素为底物的酶解体系中，实现木质纤维素的高效酶解；所述的阳离子-非离子共聚物，是由阳离子单体和非离子单体构成。

5、上述方法具体包括以下步骤：

6、将木质纤维素加入缓冲溶液中，再加入阳离子-非离子共聚物和纤维素酶，加热反应，反应结束后通过固液分离即可得到富含可发酵糖的水解液。

7、优选地，所述阳离子单体为含季铵根或含胺基的化合物，非离子单体为丙烯酰胺(am)或其衍生物。

8、优选地，所述的含季铵根的化合物包括甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(dmc)、甲基丙烯酰氧乙基二甲基苄基氯化铵(dmbac)和甜菜碱及其衍生物中的至少一种；

9、所述的含胺基的化合物包括伯胺、仲胺、叔胺中的至少一种；所述伯胺包括甲胺、乙胺、乙烯胺、甲基丙烯酸2-氨基乙酯中的至少一种；所述仲胺包括二甲胺、二乙胺、二异丙胺中的至少一种；所述叔胺包括甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯中的至少一种。

10、优选地，所述阳离子-非离子共聚物合成步骤如下：

11、在反应溶剂中加入非离子单体，链转移剂，阳离子单体，引发剂，加热升温至40～90℃，保温反应4～24h，反应结束后洗涤提纯，得到阳离子-非离子共聚物。

12、优选地，所述的反应溶剂可为但不限于乙醇、水中的至少一种；所述的链转移剂可为但不限于双(羧甲基)三硫代碳酸盐、甲酸钠、2-(((乙基硫代)碳硫酰)硫代)丙酸、2-溴丙酸叔丁酯、4-氯甲基苯乙烯、1,4－二氯甲基苯、1-苯基氯乙烷中的至少一种；所述的引发剂可为但不限于偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、偶氮二异丁酸二甲酯、过氧化氢、过硫酸铵、过硫酸钾、过氧化苯甲酰、过氧化苯甲酰叔丁酯、过氧化甲乙酮和过硫酸铵/亚硫酸氢钠中的至少一种；。

13、优选地，所述阳离子单体、非离子单体、引发剂、链转移剂和反应溶剂的质量比为99～1035：267～508：16：28：1540～3600。

14、优选地，所述缓冲溶液为醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液中的一种；所述缓冲溶液的ph为4.0～6.0，离子强度为10～200mmol/l。

15、优选地，所用缓冲液的质量是木质纤维素的5～50倍，所用木质纤维素是阳离子-非离子共聚物的4～200倍。

16、优选地，所述木质纤维素为玉米芯、玉米秸秆、松木、桉木、杨木、水曲柳、沙棘、伯树、杉木、桦木、麦秆、甘蔗渣、稻草、稻壳、食用菌基质和花生壳中的至少一种。

17、优选地，所述纤维素酶的用量以木质纤维素中的葡聚糖含量计算为3～30fpu/gglucan，纤维素酶来源为李氏木霉真菌、黑曲霉真菌中的至少一种。

18、优选地，所述加热反应是指在30～60℃下反应24～96h。

19、本发明提供了一种具有不同阳离子含量的阳离子-非离子共聚物，以提高木质纤维素酶水解效率的方法，其优点是可以通过调控共聚物中阳离子含量，减少对纤维素酶活力的影响，且助剂用量少，酶解性能强化效果明显。

20、本发明的机理为：阳离子-非离子共聚物可以增加纤维素酶蛋白的稳定性，减少纤维素酶的热失活，降低酶解过程中摇晃产生的剪切力导致的纤维素酶失活。由于阳离子-非离子共聚物带正电，而木质素在酶解体系中带负电，所以可以通过静电作用吸附在木质纤维素中的木质素上，并通过其亲水特性在表面上形成一层水化膜，可以减少纤维素酶与木质素的疏水作用，进一步降低纤维素酶在木质素上的无效吸附，让纤维素酶更高效地与纤维素进行有效结合。总之，添加阳离子-非离子共聚物可以增强纤维素酶的稳定性并减少酶在木质素上的无效吸附，从而实现木质纤维素的酶解强化。

21、与现有的技术相比，本发明具有以下优点：

22、(1)本发明以阳离子-非离子共聚物为酶解助剂，通过调节共聚物中阳离子的含量，可以实现纤维素酶酶活的提升。

23、(2)阳离子-非离子共聚物作为酶解助剂，极少的添加量即可实现木质纤维素酶解得率由39.3％提高至65.6％～79.9％。

24、(3)酶解体系中添加阳离子-非离子共聚物，通过静电作用吸附在木质素上，并在表面上形成一层水化膜，可以有效减少纤维素酶在木质素上的无效吸附，进一步促进木质纤维素的酶解。