一种新型变异盖塔病毒的实时荧光定量PCR检测方法

本发明属于病毒检测，具体涉及一种新型变异盖塔病毒的实时荧光定量pcr检测方法。

背景技术：

1、盖塔病毒（getah virus, getv）是一种经蚊虫叮咬传播、可感染人和多种动物并导致严重疾病的人畜共患传染病病毒。盖塔病毒隶属于披膜病毒科（ togaviridae）甲病毒属（ alphavirus），其基因组为非节段的线性单股正链rna，长度约为11700nt，具有2个开放阅读框（orfs），分别编码四种非结构蛋白（nsp1-nsp4）和五种结构蛋白（e1-e3、c和6k）。盖塔病毒于1955年首次从马来西亚收集的库蚊中分离，现在盖塔病毒广泛分布于东南亚及澳大利亚北部地区的13个国家。1964年从我国海南省采集的库蚊中分离到getv毒株，目前已在我国22个省份分离到getv。getv可感染马、猪、牛等多种动物，引起被感染动物发烧、皮疹、四肢水肿、腹泻、流产甚至死亡等多种症状。

2、2018年，四川省成都大熊猫繁育研究基地中出现小熊猫（red panda）死亡，在前期研究中采用宏基因组学方法对死亡小熊猫体内的组织样本中病毒群落进行分析，进行dna文库构建与高通量测序，通过对测序原始数据整理并对其中的病毒序列进行拼接比对，获得一株盖塔病毒序列，命名为 getv/scrph328/2018（ncbi genbank number：mz357111），基因组近乎完整，全长11,641nt，两个orf分别编码2466aa的非结构多聚蛋白和253aa的结构多聚蛋白。这是第一次在小熊猫身上发现getv。对其进行系统发育分析发现， getv/scrph328/2018与四川省猪群中流行的三种中国 getv 毒株紧密聚集在同一分支上，基因相似性分别为99.77%至99.84%，结果表明getv 感染宿主的范围扩大，已对四川小熊猫种群构成威胁，且可能对其他动物存在感染风险。

3、目前为止，对于getv病毒的临床检测技术主要为电镜观察、病毒分离与鉴定、血清学检测以及分子生物学检测等方法。研究尚处于萌芽阶段，尚未建立完善的检测方法。实时荧光定量pcr方法是国际公认检测病毒的方法之一，具有快速简便、特异性强、灵敏度高、重复性好和定量准确等优点。建立新型变异盖塔病毒的定量pcr检测方法有助于对getv开展广泛的分子生物学检测，及时发现感染小熊猫，阻断getv传播，对保护小熊猫健康及其生态群落稳定起重大作用。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术中的存在的问题，提供一种新型变异盖塔病毒（geta）的实时荧光定量pcr检测方法。该检测方法可以实现对待检样本中的盖塔病毒进行定量检测，具有方法简单、快速快、灵敏度高、特异性强等多项技术特点。

2、为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明提供了一种新型变异盖塔病毒的实时荧光定量pcr检测方法，所述方法包括如下步骤：

4、（1）根据genbank序列号为mz357111的新型变异盖塔病毒的structuralpolyprotein基因序列，与不同宿主来源的geta核酸序列使用geneious prime软件进行序列比对，根据比对结果，选择病毒的特异序列区域设计特异性引物geta-q和geta-e1；geta-q的上游引物为geta-qpf，下游引物为geta-qpr；geta-e1的上游引物为geta-e1-pf，下游引物为geta- e1-pr；其核苷酸序列分别如seq_1~ seq_4所示；

5、（2）以新型变异盖塔病毒的rna为模板进行逆转录得到cdna，采用步骤（1）设计的引物geta-e1-pf和geta- e1-pr进行pcr扩增，回收pcr产物获得目的基因e1的dna片段，通过同源重组的方法与酶切后线性化的质粒载体pcdna3.1ha连接，转化到dh5α大肠杆菌感受态细胞中，挑取阳性克隆提取质粒，获得重组质粒pcdna3.1ha-geta-e1标准品；

6、（3）将重组质粒pcdna3.1ha-geta-e1进行 10倍倍比稀释制备得到重组质粒标准品溶液，并以其为模板，采用特异性引物geta-qpf和geta-qpr进行sybr green ⅰ实时荧光定量pcr，以重组质粒标准品的拷贝数浓度的对数值为横坐标，ct值为纵坐标，得到线性回归方程；

7、（4）提取待测样本的总核酸，得到待测样本的cdna，并作为模板，采用特异性引物geta-qpf和geta-qpr进行sybr ⅰ 实时荧光定量pcr，并将获得的ct值带入步骤（3）所构建的标准曲线，实现待测样本中新型变异盖塔病毒的定量检测。

8、进一步的，步骤（2）中所述pcr扩增的反应体系为：模板5.0μl，prime star25μl，geta-e1-pf 1μl，geta-e1-pr 1μl，ddh2o 补至 50μl。

9、步骤（2）中所述pcr扩增的反应程序为：预变性98℃3min，变性98℃20s、退火60℃20s、延伸72℃ 1 min35个循环，延伸72℃10min，保存16℃2min。

10、步骤（2）中所述dna片段的大小为1314bp。

11、步骤（3）中所述重组质粒标准品溶液的浓度为1.69×101~1.69×108copies/μl。

12、步骤（3）中所述的线性回归方程为y=-3.1972x+36.698。

13、步骤（3）中所述的实时荧光定量pcr的反应体系为：模板1.0μl，geta-qpf (10 μm)0.1μl， geta-qpr (10 μm) 0.1μl， sybr green mix 5.0μl，ddh2o 3.8μl。

14、步骤（3）中所述的实时荧光定量pcr的反应程序为：95℃30s，95℃10s、60℃30s40个循环，95℃15s、60℃60s。

15、本发明还提供了一种用于小熊猫新型变异盖塔病毒的实时荧光定量pcr检测的通用性引物组，所述的引物组包括特异性引物geta-q和geta-e1；geta-q的上游引物为geta-qpf，下游引物为geta-qpr；geta-e1的上游引物为geta-e1-pf，下游引物为geta- e1-pr；其核苷酸序列分别如序列表中seq_1~ seq_4所示。

16、本发明还提供了一种用于小熊猫新型变异盖塔病毒的实时荧光定量pcr检测试剂盒，所述试剂盒包含有如上所述的通用性引物组。

17、本发明根据geta structural polyprotein的基因序列设计并合成特异性引物，构建重组质粒pcdna3.1ha-geta-e1，作为标准品建立了标准曲线，建立了针对新型变异盖塔病毒的实时荧光定量pcr检测体系，实现新型变异盖塔病毒geta的定量检测，对hsv等多种病毒无特异性扩增；能够检测到101copies/μl的重组质粒，是常规pcr的1000倍；组内重复的最大变异系数为1.59%，组间重复的最大变异系数为3.30%。具有特异性和敏感性高、重复性好及耗时短的优点。检测结果可直接通过电脑软件读出，不需要琼脂糖凝胶电泳以及凝胶成像检测等操作，简化实验步骤节约检测时间。为检测新型变异盖塔病毒提供了一种新的检测方法，弥补了此病毒检测的技术空白，为诊断新型变异盖塔病毒感染提供依据，在保护小熊猫及大熊猫方面发挥重要作用，具有很好的应用前景。