检测黄瓜霜霉病菌OSBPI类杀菌剂抗性基因型L798W的方法

本发明属于生物，具体涉及osbpi类杀菌剂抗性基因型l798w黄瓜霜霉病菌的lamp和caps检测方法。

背景技术：

1、黄瓜霜霉病致病菌为古巴假霜霉菌(pseudoperonosporacubensis)，是一种专性寄生菌，属于异宗配合病原菌，寄主范围广，可侵染20多种不同属的葫芦科植物，包括重要的经济作物黄瓜、哈密瓜、南瓜和西瓜等。化学防治因为防治效果快、防治效果稳定、防治药剂种类较多等特点，仍然是生产上防治此类病菌危害的最重要的手段，然而化学药剂的长期大量频繁使用，病原菌逐渐对药剂产生了抗药性，药剂防效显著降低，而加大用药量会带来农药残留、作物安全性和环境污染问题，也会增加抗性发生发展的风险。病原菌在自然界的数量巨大，抗药性个体在群体中的比例达到3％时，即可引起抗药性病害流行，导致药剂防治失败。传统的抗性菌株的检测方法主要是通过分离培养病原菌，然后在含药平板上培养，根据药剂对菌丝生长的抑制作用鉴别抗药性，该方法检测周期长，从分离到鉴定长达1周，甚至数周，且在病原菌培养过程中存在杂菌污染。近年来，随着核酸相关分子检测技术的发展，pcr技术为植物病原菌的抗药性检测提供了快速、灵敏、准确的优势，但是检测需要昂贵的实验仪器及繁琐的电泳过程，检测时间长，检测成本高昂，不能满足快速检测的需求，并且在鉴定过程中还需要接触大量有毒有害试剂，对实验操作人员存在较大的安全隐患。

2、环介导等温扩增反应(lamp)是日本学者notomi等发明的一种新颖的恒温核酸体外扩增技术，广泛应用于动物、植物等疾病的基因诊断。该技术原理是：针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换dna聚合酶在等温条件(65℃左右)保温30－60min，即可完成核酸扩增反应。在lamp的反应过程中，dna聚合酶发挥聚合作用，改变质子数量进而改变ph值，阴性的反应结果显示为粉色，阳性的反应结果会变为黄色。lamp方法的最大特点就是实现恒温扩增，不需要循环仪、凝胶成像系统等昂贵的仪器；扩增反应极快，一般在1小时内完成；通过肉眼即可判定结果；灵敏度高、特异性强；操作简便、快捷，及适于病原突变基因型的快速鉴定及检测。酶切扩增多态性序列(caps)是一类以pcr为基础的共显性的分子标记，揭示的是特异pcr产物dna序列内限制性酶切位点变异的信息，也表现为限制性片段长度的多态性。这两种技术在植物病原菌抗药性基因型检测报道很少，目前国内外尚未有黄瓜霜霉病菌对osbpi类杀菌剂抗性基因型l798w的快速分子鉴定的相关报道。

技术实现思路

1、本发明的发明人通过田间抗药性监测发现氧化固醇结合蛋白第798位氨基酸密码子由亮氨酸(l)突变为色氨酸(w)引起对osbpi类杀菌剂存在高水平抗性。

2、基于此，本发明的发明目的：本发明在抗药性机制研究的基础上，针对已有黄瓜霜霉病菌对osbpi类杀菌剂抗性菌株的鉴定方法中存在费时、费力、成本高、准确性低的缺点，提供osbpi类杀菌剂抗性基因型l798w的lamp和caps检测方法。

3、通过对黄瓜霜霉病菌的序列分析，设计了可特异性区分不同的抗性基因型的lamp引物及特定的限制性核酸内切酶，基于lamp和caps技术能快速、准确鉴定黄瓜霜霉病菌对osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w。

4、该鉴定方法具有简单、快速、成本低，灵敏度高等特点，能大大提高检测效率，对黄瓜霜霉病的抗药性治理、监测及抗药性流行预警具有重要的现实意义。

5、本发明所述的黄瓜霜霉病菌对osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w是指黄瓜霜霉病菌osbpi类杀菌剂的靶标蛋白orp1(序列表中序列7)第798位氨基酸密码子突变造成对osbpi类杀菌剂表现出高抗，即第798位氨基酸密码子ttg(leu)→tgg(trp)的突变对osbpi类杀菌剂表现出高抗。pscorp1基因(序列表中序列8)的自5’末端第2393位核苷酸由t变为g。所述osbpi类杀菌剂可以为氟噻唑吡乙酮(oxathiapiprolin)和/或fluoxapiprolin。

6、技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

7、本发明提供osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w黄瓜霜霉病菌的lamp引物组合物：由正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3组成，各引物序列具体如下：

8、fip：5′-cgcgaaccggtcccttgtttatgcgagcatgagcgtgaa-3′(序列表中序列1)；

9、bip：5′-tgacatttcctgacgcggaaggaaagcccaccaatctgac-3′(序列表中序列2)；

10、f3：5′-gcggggtttgtactttggc-3′(序列表中序列3)；

11、b3：5′-ccgtccgatctccccata-3′(序列表中序列4)。

12、本发明还提供osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w黄瓜霜霉病菌的lamp检测试剂盒，包括上述的lamp引物组合物。

13、所述lamp检测试剂盒中，还包括pcr反应试剂。

14、所述的检测osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w黄瓜霜霉病菌的lamp引物组合物或者所述的lamp检测试剂盒在检测osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w黄瓜霜霉病菌中的应用也属于本发明的保护范围。

15、本发明还提供检测osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w黄瓜霜霉病菌的lamp检测方法。

16、本发明提供的检测osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w黄瓜霜霉病菌的lamp检测方法，包括下述步骤：提取待检黄瓜霜霉病菌的dna，以提取的dna为模板，利用上述lamp检测引物组合物或lamp检测试剂盒进行lamp扩增，扩增产物若从粉色变为黄色，且进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果，若存在梯状条带，则证明所检测黄瓜霜霉病菌为osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w；若无梯状条带，则证明所检测黄瓜霜霉病菌为非osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w；若扩增产物的颜色为粉色，判定为非osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w的黄瓜霜霉病菌。

17、所述lamp扩增反应的反应体系包括12.5μl warmstart colorimetric lamp 2xmaster mix，1.6μm正向内引物fip、1.6μm反向内引物bip、0.2μm正向外引物f3、0.2μm反向外引物b3组成，1μl模板dna，加ddh2o至25μl。

18、所述方法中，lamp反应参数为61-69℃，45-90min；优选为69℃，60min。

19、在lamp的反应过程中，dna聚合酶发挥聚合作用，改变质子数量进而改变ph值，阴性的反应结果显示为粉色，阳性的反应结果会变为黄色。因此，反应结束后通过反应体系的颜色变化，来判断黄瓜霜霉病菌是否为osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w；粉色表示检测结果为阴性，是黄瓜霜霉病菌为非osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w。

20、本发明还提供另一种检测osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w黄瓜霜霉病菌的caps的引物组合：由正向内引物capsf和反向内引物capsr组成，各引物序列具体如下：

21、capsf：tgacggccatagtatgcgca(序列表中序列5)；

22、capsr：ttaatgacccgccgaactgc(序列表中序列6)；

23、本发明还提供检测osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w黄瓜霜霉病菌的caps检测方法。

24、以待测黄瓜霜霉病菌的基因组dna为模板，用序列表中序列5和序列表中序列6所示的引物进行pcr扩增，扩增得到pscorp1基因的1658bp片段，再用bgi1酶切所得的pscorp1基因片段，若酶切产物中含有1160bp和498bp片段，则所述待测黄瓜霜霉菌为osbpi类杀菌剂抗性基因型l798w；否则，为非osbpi类杀菌剂抗性基因型l798w本发明的关键技术之一是根据氧化固醇结合蛋白orp1第798位氨基酸密码子ttg(leu)→tgg(trp)的突变来设计和优选出的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法和特定的限制性核酸内切酶。为了验证能鉴定出黄瓜霜霉病菌的osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w的特异性引物序列，本发明分别选取黄瓜霜霉病菌对osbpi类杀菌剂的敏感菌株、抗性基因型l798w菌株、抗性基因型g705v菌株；以及侵染黄瓜的瓜类蔓枯病菌(didymellabryoniae)、辣椒疫霉(phytophthoracapsici)、黄瓜靶斑病菌(corynesporacassiicola)为供试材料，采用ctab法提取供试菌株的dna。具体方法如下：收集菌丝，在球磨仪中研磨2min，加入800μl 3％ctab提取液，水浴1h，加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀后，12000rpm离心10min；取上清于新离心管中，加入650μl氯仿：异戊醇(24:1)，颠倒混匀后，12000rpm离心10min；取上清于新离心管中，加入0.6倍异戊醇沉淀dna，-20℃冷却30min以上；12000rpm离心10min，倒掉异丙醇；加入800μl75％乙醇洗涤；4℃7500rpm离心5min，倒去上清，留下dna，用干燥仪干燥20min，加入50μl ddh2o溶解dna。

25、当lamp进行反应扩增时，dna聚合酶发挥聚合作用，改变质子数量进而改变ph值，阴性的反应结果显示为粉色，阳性的反应结果会变为黄色。通过显色结果所示，黄瓜霜霉病菌的osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w反应管均为黄色，其为阳性结果，而黄瓜霜霉病菌敏感菌株及其它病原菌等阴性对照反应管为粉色，为阴性结果，证明设计和优选的lamp引物组合物具有特异性。同时，反应产物经2％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察扩增的反应产物，黄瓜霜霉病菌的osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w出现了典型的梯状条带，而其它阴性对照无梯状条带。这说明该lamp引物组合物可被用于黄瓜霜霉病菌对osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w快速可靠的试剂盒鉴定。若黄瓜霜霉菌pscorp1蛋白中存在l798w的突变，则抗性菌株比敏感菌株多了一个bgi1的酶切位点，通过该酶切位点准确鉴定出l798w的抗性菌株，这两种方法为黄瓜霜霉病菌的抗性监测及抗性评估提供理论基础和技术支撑，对我国作物黄瓜霜霉病的发生流行和抗性治理具有重要的理论指导意义。

26、上述引物组合物及方法可以用于辅助筛选对osbpi类杀菌剂产生抗性的黄瓜霜霉病菌。

27、本发明提供的快速鉴定黄瓜霜霉病菌对osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w的分子生物学方法，具有灵敏度高，特异性强等特点，与现有技术相比，本发明的有益结果是：

28、1、简便易行：本发明提供的检测黄瓜霜霉病菌对osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w的lamp和caps方法克服了现有检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题，且lamp克服了pcr检测技术需要热循环仪器，不能实现快速检测的问题。本发明在69℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到黄瓜霜霉病菌对osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w菌株，不需要复杂和昂贵的仪器，能较好满足对抗性菌株的现场检测。

29、2、实用性好：pcr检测方法需要进行凝胶电泳，很容易造成产物扩散，成为实验室气凝胶污染的一个主要来源。而lamp反应只需在恒温水浴锅中进行，可以直接通过颜色变化即可直接判断结果，省去了昂贵的仪器设备及繁琐的电泳过程，增加了在农业生产中抗性监测的应用价值。

30、3、恒温扩增：本发明提供的检测黄瓜霜霉病菌对osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w的lamp方法，不像pcr法必须要热循环仪，这样就摆脱了对热循环仪的依赖，只要有温度的热源lamp反应就可以发生，极大的扩展了lamp使用范围，lamp之所以能在恒定的热源下发生反应是因为在lamp反应液中添加了甜菜碱，使双链dna处于解链的的动态平衡中，在bst dna聚合酶的作用下实现扩增。

31、4、灵敏度高：将模板dna稀释成不同的浓度，分别用lamp法和pcr法进行灵敏度检测，本发明提供的检测黄瓜霜霉病菌对osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w的lamp方法检测下限为0.01ng/μl，是pcr法检测下线的10000倍。

32、5、特异性强：本发明在设计和优选引物时，对黄瓜霜霉病菌氧化固醇结合蛋白798位进行相应的突变，将点突变落在bip的3′端，并对倒数第二位进行错配，最终优选出一套能特异性鉴定黄瓜霜霉病菌对osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w的lamp引物组合物，该方法通过2对引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于pcr引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性大大提高，假阳性出现的概率也随之降低。

33、6、准确性高：该方法几乎不受反应混合液中存在的大量外源dna和杂质的影响，不需要从样本中纯化dna，可直接利用发病组织提取dna进行快速检测，大大提高检测准确度。扩增pscorp1基因的部分序列，该序列无其他bgi1酶切位点，l798w的突变导致存在一个bgi1的酶切位点，通过caps能准确区分抗性基因型l798w。

34、7、本发明为黄瓜霜霉病菌对osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w的抗性检测提供了新的技术平台，可用于黄瓜霜霉病菌对osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w的快速检测，是国内外首次利用lamp和caps技术检测黄瓜霜霉病菌对osbpi类杀菌剂的抗性基因型l798w菌株，这种方法简便快捷，对抗性菌株的准确诊断、及时了解抗性群体发展动态、指导科学用药、降低成本及减少环境污染具有重要的现实意义。