一种假禾谷镰刀菌重寄生真菌及其鉴定方法

本发明涉及生物防治，尤其涉及一种假禾谷镰刀菌重寄生真菌及其鉴定方法。

背景技术：

1、随着人们生活水平的提高，绿色农业发展模式愈来愈受到重视，即在促进农业发展的同时，保护环境、保证农产品绿色、无污染的农业发展模式。但目前在实际生产过程中，由于作物的连作，导致某些病原菌连年积累，形成病土；另外，由于长期施用化肥和农药导致土壤的有机质减少，土壤微生物生态遭受破坏，使得土传病害连年加重。虽然人们通过化学防治技术取得了一定效果，但长期使用化学制剂，也破坏了土壤团粒结构、理化性质，使土壤生态环境进一步加重，同时也造成病原物抗药性增强、农产品药物残留等一系列问题。利用有益微生物来改善土壤中的生物群落，消除或抑制土壤中的病原菌，减少农药的使用，修复土壤生态系统将是未来绿色农业发展的必经之路。

2、重寄生是指致病寄生物能够被另一种寄生物所寄生的现象。重寄生现象在自然界中普遍存在。目前，已报道的重寄生真菌已经约100种，包括白粉寄生孢，锈菌寄生孢，盾壳霉，木霉和轮枝菌等。重寄生真菌在植物病害防治中发挥了重要的作用，如利用重寄生菌紫霉菌防治白松的松疱锈病；利用重寄生菌梨锈生座孢防治梨胶锈病；重寄生菌盾壳霉对核盘菌的生物防治；木霉对立枯丝核菌的重寄生及防病作用等等。在植物病害生物防治中，重寄生菌作为生防因子来进行开发利用已经成为了一种有效的措施。利用重寄生菌防治植物病害也符合我国农业生产可持续发展的要求。

3、小麦是一种在世界各地广泛种植的禾本科作物，也是我国主要粮食作物之一。主要集中在长江中下游冬麦区，东北春麦区、西北春冬麦区、西南麦区、青藏高原冬春麦区，其中河南、山东、河北三省每年小麦产量都占到全国小麦总产量的50％以上。植物病害是限制小麦增产的最重要原因，在我国为害小麦的病害主要有：小麦条锈病、叶锈病、秆锈病、腥黑穗病、散黑穗病、赤霉病、纹枯病、全蚀病、叶斑病等。近几年，小麦茎基腐病在我国的东北、华北、西北、内蒙古等重要小麦产区均有发生，且有逐年增重的趋势，已经成为严重威胁小麦安全生产的重大病害之一，造成小麦大面积减产。但是由于该病害属土传病害，使用化学防治方法难以奏效，而且化学药剂的使用还会造成病原菌抗药性增强和由此带来的环境污染。本发明中以小麦茎基腐病菌的重寄生菌kf-m为研究对象，通过重寄生菌的分离、鉴定，以及重寄生真菌对小麦茎基腐病菌的抑制效果等实验，证明重寄生真菌kf-m对假禾谷镰刀菌具有良好的重寄生效果以及一定生防作用，具有广阔的发展前景。

技术实现思路

1、1.要解决的技术问题

2、本发明的目的是为了解决现有技术中小麦茎基腐病使用化学防治方法难以奏效，且化学药剂的使用还会造成病原菌抗药性增强和由此带来的环境污染的问题，因而提出的一种假禾谷镰刀菌重寄生真菌及其鉴定方法。

3、2.技术方案

4、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

5、一种假禾谷镰刀菌重寄生真菌，包括重寄生真菌kf-m，从河南省开封市小麦田地里小麦茎秆上分离的一株假禾谷镰刀菌上分离得到，已于2022年01月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.40059。

6、本发明中还提出了一种假禾谷镰刀菌重寄生真菌的鉴定方法，包括以下步骤：

7、步骤1：重寄生真菌kf-m的分离与纯化；

8、步骤2：重寄生真菌kf-m的鉴定；

9、步骤3：重寄生真菌kf-m不同培养条件下生长情况测定；

10、步骤4：重寄生真菌kf-m重寄生现象验证；

11、步骤5：重寄生真菌kf-m寄生后对寄主真菌影响的测定；

12、步骤6：重寄生真菌kf-m寄生后对寄主真菌致病力的影响。

13、优选地，重寄生真菌kf-m的分离与纯化包括以下步骤：

14、s1.1：通过组织分离法分离得到一株表面有小黑点的假禾谷镰刀菌，将300ml蒸馏水倒入500ml锥形瓶中，置于高压蒸汽灭菌锅中在121℃条件下灭菌30min，即可得到无菌水，在超净工作台中用移液枪吸取2ml无菌水在该假禾谷镰刀菌的平板培养基上反复冲洗；

15、s1.2：将冲洗得到的液体用无菌的双层擦镜纸过滤得到假禾谷镰刀菌及其寄生真菌kf-m的孢子混合液，用移液枪吸取50μl孢子液滴在pda平板培养基上，使用涂布器使得孢子液在培养皿上分布均匀，在显微镜下挑取单个该寄生真菌的孢子到新的pda平板培养基上。

16、优选地，重寄生真菌kf-m的鉴定包括以下步骤：

17、s2.1：重寄生真菌kf-m的形态学鉴定，将重寄生菌的单个孢子在pda平板培养基上长出菌落后，对其在pda培养基上菌落形态、菌丝形态、孢子形态、孢子器形态进行观察，菌丝形态、孢子形态、孢子器形态使用光学显微镜进行观察，同时孢子形态和孢子器形态使用扫描电镜进行观察；

18、s2.2：重寄生真菌kf-m的分子生物学鉴定，首先在超净工作台中制作pda平板培养基，在培养基上平铺灭菌处理的玻璃纸，在铺有玻璃纸的pda平板培养基上活化重寄生真菌kf-m，收集菌丝，然后提取重寄生真菌kf-m的基因组dna，再将提取的dna用rdna-its通用引物进行pcr扩增。

19、优选地，所述s2.1中重寄生真菌扫描电镜样品制备方法包括以下步骤：

20、s2.1.1：在固体pda平板培养基中培养该重寄生真菌，用镊子将灭菌处理的1.5cm×1.5cm规格的铝箔片以45°夹角插入培养基中，让真菌爬片生长；

21、s2.1.2：将盖玻片轻轻拔出，用磷酸缓冲液将盖玻片上多余的培养基洗掉，将盖玻片放到预装有2.5％戊二醛溶液中(有菌丝的一面朝上)，室温或者4℃固定12h以上；

22、s2.1.3：依次用50％、60％、70％、80％、90％、95％和100％乙醇脱水，每次脱水时间为5～10min，并用乙醇-叔丁醇溶液置换10min，再用100％叔丁醇溶液置换2次，每次10min；

23、s2.1.4：置换完毕后将样品放置-20℃冰箱中预冷，冷冻干燥处理，离子溅射仪喷镀后，扫描电子显微镜观察、拍照。

24、优选地，所述重寄生真菌kf-m的基因组dna提取方法为ctab法，具体包括以下步骤：

25、s2.2.1：将放在玻璃纸上培养5d的菌丝取出，用灭过菌的药匙轻轻刮取菌丝0.1g，放入研钵中，向其中加入适量液氮，研磨成粉末，放入2ml的ep管中，向其中加入预热到65℃的ctab 800μl，放入水浴锅中水浴30min，每隔15min翻转一次；

26、s2.2.2：水浴完成后，向ep管中加入苯酚400μl，再加入氯仿400μl，混匀，12000r/min离心20min，取上清600μl，放入1.5ml ep管内，加入等体积氯仿，再次抽提，12000r/min离心20min；

27、s2.2.3：吸取上清液500μl，放入1.5ml ep管中，向其中加入等体积的异丙醇，轻轻摇匀后放入-20℃冰箱内沉淀30min，之后放入离心机中12000r/min离心15min；

28、s2.2.4：弃去上清液，然后用70％的乙醇清洗沉淀，两次之后，于37℃烘箱干燥后，加入30μl的ddh2o溶解，之后放入-20℃冰箱备用。

29、优选地，所述步骤2中包括对重寄生真菌kf-m在不同培养基条件和不同ph、温度条件下生长情况的测定。

30、优选地，所述重寄生真菌kf-m重寄生现象验证的具体方法为：在距pda平板培养基中心2cm处一侧放置假禾谷镰刀菌，另一侧对称放置重寄生真菌kf-m，把不接种重寄生真菌kf-m作为对照，每个处理3个重复，倒置于28℃恒温恒湿培养箱中倒置培养，观察结果并拍照。

31、优选地，所述重寄生真菌kf-m寄生后对寄主真菌影响的测定具体包括以下步骤：在假禾谷镰刀菌与重寄生真菌kf-m寄生后的菌株pda平板培养基上用5mm的打孔器打出大小一致的菌饼，将菌饼带菌丝面分别放置到pda培养基平板中央，把不接种重寄生真菌kf-m，仅在pda平板培养基中央放置假禾谷镰刀菌作为对照，每个处理进行3个重复，倒置于恒温培养箱中在28℃条件下培养4d，观察结果，统计生长速率并拍照。

32、优选地，所述重寄生真菌kf-m寄生后对寄主真菌致病力影响的研究具体包括以下步骤：

33、s3.1：提前5-6d用灭菌后的基质种植小麦；

34、s3.2：在假禾谷镰刀菌与重寄生真菌kf-m寄生后的菌株pda培养基平板上用5mm的打孔器在距离菌落边缘相同距离的位置打出大小一致的菌饼，同时在仅有假禾谷镰刀菌的pda平板培养基上用5mm的打孔器在距离菌落边缘相同距离的位置打出大小一致的菌饼；

35、s3.3：将小麦均匀放置于消毒后的盘子里，小麦胚芽鞘接种试验每个胚芽鞘接种1个菌饼，做4个重复。接种后，将含有适量水分的吸水纸放于小麦根部，用保鲜膜封闭好(利于保湿)并用黑布盖好，25℃黑暗培养24h；

36、s3.4：24h以后，移去黑布，25℃条件下，光照与黑暗交替，培养2d左右(具体时间根据假禾谷镰刀菌侵染植株产生的病斑情况而定)观察侵染情况并拍照。

37、3.有益效果

38、相比于现有技术，本发明的优点在于：

39、本发明中，重寄生真菌kf-m寄生假禾谷镰刀菌后，可以明显降低假禾谷镰刀菌的生长速率，同时抑制假禾谷镰刀菌气生菌丝的生长，被寄生的假禾谷镰刀菌的致病力明显降低，从而可以实现对小麦茎基腐病的有效防治。