烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其方法和用途与流程

本公开属于分子生物学和生物工程领域，具体涉及烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体、重组多肽、编码多肽或重组多肽的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞、细胞培养物，以及生产辅酶i的方法。

背景技术：

1、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)，也称氧化型辅酶ⅰ，是参与许多生理过程的重要辅因子，包括代谢、翻译后蛋白修饰和dna修复。它既是能源生产的驱动者，又是信号分子，这突出了它在健康和疾病中的重要性。在生物体内，nad的产生和降解之间的平衡有助于调节nad水平。许多研究表明，nad水平随着年龄的增长而降低，nad代谢的恶化会导致一些与年龄相关的疾病，包括代谢性和神经变性疾病以及各种癌症。相反，nad代谢的上调，包括饮食中补充nad前体，已被证明可以防止nad的下降，并对衰老和与衰老相关的疾病具有有益的作用。此外，许多研究表明，nad代谢的遗传和/或营养激活可以延长不同生物体的寿命。总之，nad代谢在衰老和长寿中起着重要作用。

2、目前，工业上合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法主要为从酵母中提取分离获得。该方法生产所需能源和材料等成本高，限制了其生产和后续应用开发。

3、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸也可通过体外酶法催化而获得，如可通过催化前体烟酰胺单核苷酸(nmn)和三磷酸腺苷或者烟酰胺核甘(nr)和三磷酸腺苷反应得到nad，例如引用文献1公开的方法中，通过定点突变构建了烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，将所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体添加至含有5-10mm烟酰胺单核苷酸(nmn)、10mm的三磷酸腺苷二钠(atp)、100mm tris盐酸缓冲液和终浓度为10mm mgcl2的反应体系中，在ph至7.5条件下37℃反应10分钟反应得到nad；引用文献2公开的方法中，通过定点突变构建的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，将所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体添加至含有5mm烟酰胺单核苷酸(nmn)、10mm的三磷酸腺苷二钠(atp)、100mm tris盐酸缓冲液和终浓度为10mmmgcl2的反应体系中，在ph至7.5条件下水浴25℃反应20小时反应得到nad。但是，现有烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶及其突变体，存在底物浓度耐受低、酶活偏低、反应时间长的缺陷，不能满足工业化生产nad的使用。

4、因此，若能提供耐受高浓度底物且高催化活性的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶，对于工业化生产合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸成本的降低、生产效率的提高都具有非常重要的意义。

5、引用文献：

6、引用文献1：cn103710321b；

7、引用文献2：cn112574970a。

技术实现思路

1、发明要解决的问题

2、鉴于现有技术中存在的问题，例如，烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶对底物的耐受性差、催化活性低等问题。本公开旨在提供烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其应用。本公开以来源于methanocaldococcus infernus的野生型烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶为改造起点，通过人工引入突变，改变其催化性能。

3、本公开提供的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体酶活性及底物耐受性较野生型均显著提高，适于工业化大规模生产。

4、用于解决问题的方案

5、本公开记载了如下技术方案。

6、[1].烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其中，所述突变体选自如下(i)-(iv)组成的组中的任一项：

7、(i)所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体和seq id no:1所示的序列相比，在对应于seq id no:1所示序列的至少第91和127位中的一个或多个位置处包含突变；

8、(ii)与(i)所示序列具有至少98％的序列同一性，且不包括seq id no:1所示序列的突变体；

9、(iii)由多核苷酸编码的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，所述多核苷酸在非常高严格条件下与(a)或(b)所示的多核苷酸杂交：

10、(a)编码如(i)所示氨基酸序列的突变体的多核苷酸；

11、(b)(a)的全长互补多核苷酸；

12、(iv)由(i)、(ii)或(iii)任一项所示的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的片段，并且，所述片段仍然具有烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶活性。

13、[2].根据[1]所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其中，所述突变体为包含如下(c)或(d)所示的突变的突变体：

14、(c)对应seq id no:1所示序列的第91位的氨基酸由精氨酸(r)突变为脯氨酸(p)；

15、(d)对应seq id no:1所示序列的第121位的氨基酸由谷氨酸(e)突变为苏氨酸(t)；

16、优选地，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体包含如seq id no:2或seq idno:3所示的氨基酸序列。

17、[3].根据[1]或[2]所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其中，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体包括在(i)所示序列的突变体的n端或c端部位缺失或添加至少一个氨基酸残基。

18、[4].一种重组多肽，其中，所述重组多肽包括[1]～[3]任一项所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体。

19、[5].一种分离的多核苷酸，其包含编码如[1]～[3]任一项所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的核苷酸序列，或包含编码[3]所述的重组多肽的核苷酸序列。

20、[6].一种核酸构建体，其中，所述核酸构建体包含[5]所述的分离的多核苷酸，所述多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列为包含启动子和/或核糖体结合位点的核苷酸序列，并且所述调控序列指导所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的基因在宿主细胞中表达并合成突变体酶。

21、[7].一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含[5]所述的多核苷酸，或[6]所述的核酸构建体。

22、[8].一种重组宿主细胞或重组基因工程菌，其中，所述重组宿主细胞或重组基因工程菌包含[1]～[3]任一项所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体、[4]所述的重组多肽、[5]所述的分离的多核苷酸、[6]所述的核酸构建体，或者[7]所述的重组表达载体。

23、[9].根据[8]所述的重组宿主细胞或重组基因工程菌，其中，所述重组宿主细胞或基因工程菌来源于埃希氏杆菌属(escherichia)、欧文氏菌属(erwinia)、沙雷氏菌属(serratia)、普罗维登斯菌属(providencia)、肠道菌属(enterobacteria)、沙门氏菌属(salmonella)、链霉菌属(streptomyces)、假单胞菌属(pseudomonas)、短杆菌属(brevibacterium)或棒状杆菌属(corynebacterium)的微生物；

24、优选地，所述基因工程菌来源于大肠杆菌(escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)或枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)；更优选地，所述基因工程菌来源于大肠杆菌(escherichia coli)。

25、[10].一种包含根据[8]或[9]所述的重组宿主细胞或重组基因工程菌的细胞培养物。

26、[11].根据[1]～[3]任一项所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，根据[4]所述的重组多肽、根据[5]所述的分离的多核苷酸、根据[6]所述的核酸构建体，根据[7]所述的重组表达载体，根据[8]或[9]所述的重组宿主细胞或重组基因工程菌，或者根据[10]所述的细胞培养物在生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及其衍生物中的应用。

27、[12].一种生产辅酶的方法，所述方法包括培养根据[1]～[3]任一项所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，根据[4]所述的重组多肽、根据[5]所述的分离的多核苷酸、根据[6]所述的核酸构建体，根据[7]所述的重组表达载体，根据[8]或[9]所述的重组宿主细胞或重组基因工程菌，或者[10]所述的细胞培养物的步骤；

28、可选地，所述辅酶包括辅酶i；

29、可选地，所述方法以烟酰胺单核苷酸为原料，还包括纯化或分离所述辅酶i的步骤；

30、可选地，所述方法以三磷酸腺苷或其盐为磷酰基供体，所述烟酰胺单核苷酸与三磷酸腺苷或其盐的摩尔比为1:1.0～1:1.5，优选为1:1.0～1:1.2；

31、优选地，在生产辅酶的步骤中，还包括镁离子，所述镁离子的浓度为5～40mm，优选为10～20mm；

32、优选地，在生产辅酶的步骤中，底物浓度5～250mm、ph7.5～9.0、反应温度为30℃～50℃。

33、[13].一种制备[1]～[3]任一项所述的突变体的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶方法，所述方法包括培养含有[8]或[9]所述重组宿主细胞或重组基因工程菌，然后从重组宿主细胞或重组基因工程菌或其培养物中回收所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的步骤。

34、发明的效果

35、在一些实施方式中，本公开提供了烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其应用。

36、在一些实施方式中，本公开的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，与野生型相比，催化活性显著提高。

37、在一些实施方式中，本公开的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其可将高浓度(100～250mm)的底物烟酰胺单核苷酸催化生成辅酶i。

38、在一些实施方式中，本公开的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体催化效率高、反应时间短，为辅酶i的合成节约了成本，提高了该产品的市场竞争力。

39、在一些实施方式中，本公开的重组多肽、分离的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体分别包含或表达上述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，可应用于辅酶i的工业生产。

40、在一些实施方式中，本公开的生产辅酶i的方法，利用了上述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，或重组多肽、重组宿主细胞等，能够实现辅酶i的稳定、高效生产。