一组检测肺炎链球菌的引物探针及其检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物诊断领域，具体涉及一组检测肺炎链球菌的引物探针及其检测试剂盒。

背景技术：

1、肺炎链球菌(streptococcus pneumonia，s.pn)为革兰染色阳性双球菌，是人类呼吸道的常见病原体，可引起肺炎、中耳炎、脑膜炎、菌血症和败血症等疾病。儿童、老年人以及免疫力低下的慢性病患者或接受免疫抑制治疗的患者是肺炎链球菌感染的高危人群。在化脓性球菌中，肺炎链球菌的致病力仅次于金黄色葡萄球菌。不同的是，到目前为止，肺炎链球菌极少对青霉素类抗生素产生耐药性。肺炎球菌主要的致病物质是肺炎球菌溶血素及荚膜。荚膜具有抗原性，是肺炎链球菌分型的依据。

2、现有技术中对肺炎链球菌的快速检测方法如下：1、传统的培养方法(国标法)，即从血液或胸腔积液培养分离获得sp仍然作为诊断的金标准；2、乳胶凝集法，该法是一种针对肺炎球菌荚膜抗原的免疫学凝集方法；3、自动化方法，目前微生物检测的自动化仪器已普遍使用，对于肺炎链球菌检测常见方法有：api20strep鉴定试条、vltek ams系统、phoenix smic/id鉴定板和micro—san walk away等；4、免疫层析法(immunochromatography，ict)，目前广泛用于sp诊断的快速方法，其检测为sp各血清型所共有的抗原c多糖。该方法可用于检测尿液、胸腔积液、脑脊液和支气管灌洗液；5、核酸扩增技术，pcr(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)属于一种核酸体外扩增技术，靠寡核苷酸指导的dna合成的重复循环来实现对靶核酸序列的扩增，并采用凝胶电泳或探针杂交检测扩增的dna；6、实时荧光定量pcr技术。

3、荧光定量pcr检测肺炎链球菌已有大量研究，如cn102876774a公开了针对lyta基因检测肺炎链球菌的引物和探针、cn114854888a公开了基因hkm25检测肺炎链球菌的引物和探针，这些研究所公开的实验均采用完整肺炎链球菌基因组dna为检测标的，但是动物或人感染肺炎链球菌时，肺炎链球菌能短暂侵入血液循环系统或细胞，导致一过性的菌血症或炎症，这些入侵微生物会被宿主免疫系统及抗感染药物杀灭，导致微生物dna释放到循环中，在核酸外切酶的存在下形成称为cfdna(cell-free dna，cfdna)的小片段，它们的大小基本上在150-200bp左右，且在感染性疾病状态下，血液cfdna含量明显增加，cfdna来源于核基因组、线粒体基因组和微生物基因组，其中人类dna占比超过90％，甚至超过99％，而微生物cfdna只占一小部分，进一步的研究表明，微生物cfdna的半衰期仅几分钟，主要通过肝脏清除，短于nudna(10-15分钟)；血清微生物cfdna由于其非侵入性和可获得性，已被用作广泛病原体感染的生物样品，然而血清微生物cfdna因其片段小、含量低、半衰期短，极易出现漏检，导致其检测应用仍面临着前所未有的挑战，尚未见到针对血清肺炎链球菌cfdna的pcr检测的报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一组检测肺炎球菌的引物探针及其检测试剂盒，以便于血清肺炎球菌cfdna的检测。

2、本发明公开了一组检测肺炎球菌的引物探针，包含hpt、pspc、ychf基因的定量pcr引物和探针，其中所述hpt的定量pcr引物和探针序列如seq id no.1～seq id no.3所示；所述pspc的定量pcr引物和探针序列如seq id no.4～seq id no.6所示；所述ychf基因的定量pcr引物和探针序列如seq id no.7～seq id no.9所示；

3、本发明的上述引物，是通过大量试验的优化筛选出的高效稳定扩增的检测引物。通过引物的具体序列设计，本发明的所述探针，也是通过大量试验的优化而筛选出特异性强的检测探针。通过探针的具体序列设计，并结合探针的长度和位置的调整，提高检测灵敏度(检出限为15.8copies/ul)及特异性。

4、hpt基因是次黄嘌呤转磷酸核糖基酶，是嘌呤核苷酸补救合成的关键酶之一，以嘌呤为底物，催化合成nmp(嘌呤核苷酸)，是生物体内重要的酶之一，可有效缓解嘌呤核苷酸降解及排出的压力。

5、pspc基因是一种表面蛋白，可刺激肺上皮细胞合成il-8，参与宿主免疫细胞的激活和趋化作用。

6、ychf基因是一种氧化还原有关的atp酶，主要参与菌体呼吸作用的代谢途径中来，为菌体活动提供能量。；

7、本发明公开了一种肺炎球菌的血清检测试剂盒，其包含本发明所述定量pcr引物和探针，它们的核酸序列如seq id no.1～seq id no.9所示；

8、在一些优选项中，所述血清检测试剂盒，还包含核酸扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品；

9、在一些优选项中，所述探针为寡核苷酸探针，其5’末端携带荧光基团，3’端携带mgb基团,所述探针标记同一波长荧光基团；5’端标记的荧光基团为选自fam、hex、cy5、tet、joe、cy3、tamra、rox、vic中的任一种。

10、本发明公开了一种克罗诺杆菌的血清检测方法，包括下列步骤：

11、s1.受试者血液样品采集；

12、s2.制备血清样品；

13、s3.采用本发明所述血清检测试剂盒进行pcr扩增检测；

14、s4.分析pcr结果。

15、在一些优选项中，所述受试者为哺乳动物、禽鸟或鱼类，所述哺乳动物任选地人、牛、猪、奶牛、绵羊、猪、狗、骆驼、马、美洲驼、山羊、兔、猫、大鼠、小鼠、雪貂、豚鼠、水貂或其它模型生物；

16、在一优选项中，所述pcr扩增条件为预变性95℃，3min；变性95℃，10sec，延伸60℃，20sec，40个循环；

17、在一优选项中，所述pcr扩增条件还在预变性步骤前增加去污染步骤，条件为37℃，2min。

18、本发明的有益效果：本发明技术方案解决了由于cf dna片段化、含量低导致检测灵敏度较低的问题，可大大提高宿主血液中病原菌核酸的检测灵敏度，相比传统的抗原检测，还具有特异性高，时间短，操作简单的优势。

技术特征：

1.一组检测肺炎链球菌的引物探针，包含hpt、pspc、ychf基因的定量pcr引物和探针，其中所述hpt的定量pcr引物和探针序列如seq id no.1～seq id no.3所示；所述pspc的定量pcr引物和探针序列如seq id no.4～seq id no.6所示；所述ychf基因的定量pcr引物和探针序列如seq id no.7～seq id no.9所示。

2.如权利要求1所述的引物探针，其特征在于所述探针为寡核苷酸探针，其5’末端携带荧光基团，3’端携带mgb基团,所述探针标记同一波长荧光基团。

3.如权利要求2所述的引物探针，其特征在于所述探针的5’端标记的荧光基团为fam、hex、cy5、tet、joe、cy3、tamra、rox、vic中的一种。

4.如权利要求2所述的超灵敏定量pcr检测技术，其特征在于所述探针的所述探针的3’端标记的淬灭基团为bhq1、bhq2、bhq3、dabcyl中的任一种。

5.一种肺炎链球菌的血清检测试剂盒，其包含权利要求1所述定量pcr引物和探针。

6.如权利要求5所述的血清检测试剂盒，其特征在于所述探针为寡核苷酸探针，其5’末端携带荧光基团，3’端携带mgb基团,所述探针标记同一波长荧光基团。

7.如权利要求1所述的血清检测试剂盒，其特征在于所述探针的5’端标记的荧光基团为fam、hex、cy5、tet、joe、cy3、tamra、rox、vic中的一种。

8.一种肺炎链球菌的血清检测方法，包括下列步骤：

9.如权利要求8所述的血清检测方法，其特征在于所述受试者为哺乳动物、禽鸟或鱼类。

10.如权利要求8所述的血清检测方法，其特征在于所述pcr扩增条件为预变性95℃，3min；变性95℃，10sec，延伸60℃，20sec，40个循环。

技术总结
本发明属于生物诊断领域，具体涉及一组检测肺炎链球菌的引物探针及其检测试剂盒。本发明公开了一组检测肺炎链球菌的引物探针，包含HpT、PspC、YchF基因的定量PCR引物和探针。本发明技术方案解决了由于cf DNA片段化、含量低导致检测灵敏度较低的问题，可大大提高宿主血液中病原菌核酸的检测灵敏度，相比传统的抗原检测，还具有特异性高，时间短，操作简单的优势。

技术研发人员：张帆,郑贤杰
受保护的技术使用者：天筛（上海）科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13