一种基于荧光素酶报告基因系统鉴定circSMARCA5的方法

本发明涉及基因工程，更具体的说是涉及一种基于荧光素酶报告基因系统鉴定circsmarca5的方法。

背景技术：

1、circsmarca5是一种环状rna分子，是由smarca5基因的前体mrna通过剪接反应形成的。smarca5基因编码一种重要的atp依赖性染色质重塑酶，在调节基因转录、dna复制和修复等方面具有关键作用。circsmarca5是一种高度保守的circrna，在多种癌症中发现了它的异常表达，例如胃癌、肝癌、结直肠癌和乳腺癌等。研究表明，circsmarca5参与了癌症的发生和发展过程，可能作为一种潜在的生物标志物和治疗靶点。

2、现有技术鉴定circrna的方法主要分为两种，其一是rnase r消化检测鉴定circrna，其二是利用反向引物pcr/qpcr扩增鉴定circrna。

3、首先，rnase r消化检测鉴定circrna的原理是rnase r可以沿rna的3’-5’方向切割、降解rna，能够消化几乎所有的线性rna分子，但不易消化呈环形的rna、套索结构或3’端突出末端少于7nt的双链rna分子，这种方法可以作为一个很典型的实验证明和鉴定circrna。但其缺陷在于rnase r并不是绝对的不能消化circrna，消化时间过长、rnase r的用量过高都有可能会导致在酶消化后circrna的含量也有明显降低甚至完全降解，导致试验结果不准确。并且该技术只能检测某个样品的某个阶段的circrna的形成，不能实时检测circrna的形成变化。

4、利用反向引物进行pcr/qpcr鉴定circrna，可通过引物特异性位点设计来保证所检测的为环状rna。设计正向引物作为参照，不管是基因组或线性rna还是环状rna均可扩增，而反向引物只有环状rna可以被扩增出来。这个方法的缺陷在于不能实时检测circrna的形成变化。

5、因此，提供一种基于荧光素酶报告基因系统鉴定circsmarca5的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种基于荧光素酶报告基因系统鉴定circsmarca5的方法，可以体外鉴定circsmarca5的形成，并基于荧光素酶报告基因系统实时监测其形成的实时变化。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、pgl4-circsmarca5-luc-cmv-ires2重组载体在检测circsmarca5形成中的应用。

4、进一步，所述的pgl4-circsmarca5-luc-cmv-ires2重组载体在检测circsmarca5形成变化中的应用。

5、进一步，所述pgl4-circsmarca5-luc-cmv-ires2重组载体的构建方法如下：

6、(1)将pgl4.10载体酶切线性化获得pgl4线性化载体，把circsmarca5片段整合到pgl4.10线性化载体中，构建pgl4-circsmarca5重组载体；所述circsmarca5片段的序列如seq id no.1所示；

7、(2)将luciferase片段整合到pgl4-circsmarca5重组载体中，构建pgl4-circsmarca5-luc重组载体；所述luciferase片段的序列如seq id no.2中第100bp-1752bp所示；

8、(3)将cmv-ires2片段整合到pgl4-circsmarca5-luc重组载体中，构建pgl4-circsmarca5-luc-cmv-ires2重组载体；所述cmv-ires2片段的序列如seq id no.7所示。

9、进一步，一种基于荧光素酶报告基因系统鉴定circsmarca5的方法，利用所述的pgl4-circsmarca5-luc-cmv-ires2重组载体进行鉴定。

10、本发明通过体外克隆circsmarca5片段，并将其片段分段连接到改造的荧光素酶报告基因报告质粒上，当circsmarca5形成时利用其成环的特性，即可催化荧光素酶报告基因发光。另外，设置阴性对照空质粒组，这样便可通过双荧光素酶报告实验检测circsmarca5是否存在。同时，还可以采用kronos-ab2550细胞实时生物荧光测定系统实时监测circsmarca5形成时所造成的荧光素酶活性的变化，进一步确定其真实存在性及实时监测其形成的实时变化。

11、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种基于荧光素酶报告基因系统鉴定circsmarca5的方法，可通过双荧光素酶报告实验检测circsmarca5是否存在；同时，还可以采用kronos-ab2550细胞实时生物荧光测定系统实时监测circsmarca5形成时所造成的荧光素酶活性的变化。本发明与现有技术相比，其优点在于既可以鉴定circsmarca5的真实存在，又可以实时监测circsmarca5在细胞中的形成变化。

技术特征：

1.pgl4-circsmarca5-luc-cmv-ires2重组载体在检测circsmarca5形成中的应用。

2.权利要求1中所述的pgl4-circsmarca5-luc-cmv-ires2重组载体在检测circsmarca5形成变化中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述pgl4-circsmarca5-luc-cmv-ires2重组载体的构建方法如下：

4.一种基于荧光素酶报告基因系统鉴定circsmarca5的方法，其特征在于，利用权利要求1或2中所述的pgl4-circsmarca5-luc-cmv-ires2重组载体进行鉴定。

技术总结
本发明公开了一种基于荧光素酶报告基因系统鉴定circSMARCA5的方法，属于基因工程技术领域。本发明公开的一种基于荧光素酶报告基因系统鉴定circSMARCA5的方法，利用pGL4‑circSMARCA5‑Luc‑CMV‑IRES2重组载体进行鉴定。本发明方法既可以鉴定circSMARCA5的真实存在，又可以实时监测circSMARCA5在细胞中的形成变化。

技术研发人员：陈华涛,高登科,靳亚平,王爱华,刘薇,刘田,马白荣
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13