用于肾功能损伤监控的生物标志物及试剂盒的制作方法

本发明涉及医学和生物，尤其涉及用于肾功能损伤监控的生物标志物的检测试剂盒以及用于诊断肾功能损伤的诊断试剂盒。

背景技术：

1、肾功能损伤包括急性肾功能衰竭、急慢性肾炎及红斑狼疮以及高血压糖尿病等引起的慢性肾功能损伤，肾功能损伤在临床并不少见。近年来，全球肾病的发病率呈逐年上升的趋势。作为继肿瘤、心脏病之后的第三大“杀手”，医务工作者在临床诊断中却很难知晓早期肾损伤。这主要是由于早期肾损伤症状不明显，很容易延误病情。目前，临床判断肾脏损伤采用化验尿常规、渗透压、血肌酐、尿蛋白、尿素氮、内生肌酐清除率等几项指标，但多数情况下当这些指标增高时，肾脏损害已经非常严重，肾脏功能已失代偿，很多这样的肾损伤预后不佳。因此，寻找能早期发现肾脏疾病的指标已成为医学界的热点之一。随着糖尿病、高血压等疾病的患者越来越多，血管病变累及肾功能受损的现象也越来越普遍。

2、目前临床检测肾功能受损的标志主要是血浆肌酐尿素氮水平的升高。由于肾脏的强大代偿功能，早期肾功能受损没有临床症状，只有肾脏总代谢能力的丧失超过50-60％以上，血浆肌酐尿素氮水平才会累积升高(参见图1，当前肾损伤检测是否满足临床需求)，出现严重的病理症状，预后较差。所以血浆肌酐尿素氮只是晚期肾功能损伤失代偿的标志，不能反映早期肾功能受损，不能作为早期检测轻中度肾损伤的方法，临床需要更敏感的检测方法。

3、此外，通过大量的动物实验和临床研究发现，不同的病因会导致肾脏不同部位的肾损伤，如药物和心衰引起的急性肾损伤包括急性肾小管坏死等多开始发生在肾近曲小管，慢性肾炎和高血压糖尿病等慢性肾功能损伤多累及肾小球。不同部位的肾损伤治疗有所不同，预后也差异很大。当前临床以血浆肌酐尿素氮的变化来检测肾功能不全，只反映肾脏受损，不能提供肾脏病变部位的信息。

4、medibeacon’s系统是用于临床前监测肾小球滤过率(gfr)的装置。该系统允许研究人员计算和跟踪动物的肾脏功能随时间的推移的连续变化，监测过程中动物仍保持清醒的活动状态，使用方法为将设备和贴片贴在动物身上，使用荧光剂示踪后，通过设备配备的软件分析处理数据。然而，这种系统在临床上无法使用，只能作为实验设备。无创尿液检查替代贴片设备和采血设备对肾功能损伤进行监测、监测复发及判断预后，一直是研究的热点。然而，现在还没有任何成熟的方案，从而影响了通过尿液脱落细胞的基因标志物监测肾功能损伤相关技术的发展。这种通过尿液脱落细胞中肾损伤相关基因标志物的表达来检测肾损伤的方法目前还没有报道。由此，建立一种能检测出早期肾损伤的灵敏方法，及时预警病人，并施以有效处理和治疗，避免或延缓不可逆的严重后果，是临床急需的。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了如下技术方案，用于肾功能损伤监控的生物标志物的检测试剂盒以及用于诊断肾功能损伤的诊断试剂盒，可以通过检测脱落细胞中特定的与肾损伤相关的基因标记物(mrna)的表达水平来获得一种无创尿液肾功能损失诊断和复发监控的试剂盒。近年来，一系列与肾损伤相关的蛋白质和基因(mrna)标记物被发现和报道，在动物实验和临床实验中得到证实。这些标志物分别产生于肾脏不同部位的细胞(参见图2(a)和图2(b))，在肾脏受损的较早期就会出现在尿液中。病变累及部位的受损上皮细胞会脱落在尿液中，所以在肾脏受损的病人尿液中，往往会有较多量的脱落细胞和细胞碎片。通过采用现代分子诊断学的手段和自行设计的pcr引物和探针，获得一种在尿液脱落细胞中检测一系列与肾损伤相关的基因标志物的方法和试剂盒，如kim-1,alpha-gst,mu-gst,osteopontin,ngal,clusterin,wt-1,pododin，col4a4和atf-3等等，只要在样本中汲取1.5毫升尿液，采用荧光定量rt-pcr技术，可快速灵敏地同时检测上述一系列肾损伤相关标记物，对肾损伤作出早期判定，根据脱落细胞中各个标记物表达量的变异，提示肾损伤的可能累及部位。尿液取样简单无损伤，容易被病人接受。成本低，益于临床推广。

2、本发明一方面提供了一种用于检测肾功能损伤生物标志物的检测试剂盒，包括用于检测尿液脱落细胞和细胞碎片中的所述肾功能损伤生物标志物的引物和探针，所述肾功能损伤生物标志物为选自基因kim-1,α-gst,mu-gst,osteopontin,ngal,clusterin,wt-1,pododin，col4a4和atf-3中的至少一种。

3、本发明的第二方面提供用于检测所述生物标志物的引物：其中

4、用于检测kim-1的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seq id no:1和seqid no:2所示；

5、用于检测α-gst的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seq id no:4和seqid no:5所示；

6、用于检测mu-gst的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seq id no:7和seqid no:8所示；

7、用于检测osteopontin的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seq id no:10和seq id no:11所示；

8、用于检测ngal的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seq id no:13和seqid no:14所示；

9、用于检测clusterin的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seq id no:16和seq id no:17所示；

10、用于检测wt-1的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seq id no:19和seqid no:20所示；

11、用于检测col4a4的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seq id no:22和seqid no:23所示；

12、用于检测atf-3的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seq id no:25和seqid no:26所示。

13、本发明的第三方面提供用于检测所述生物标志物的探针，对应于kim-1,α-gst,mu-gst,osteopontin,ngal,clusterin,wt-1,pododin，col4a4和atf-3，所述探针的核苷酸序列分别如seq id no:3、seq id no:6、seq id no:9、seq id no:12、seq id no:15、seqid no:18、seq id no:21、seq id no:24、seq id no:27所示。

14、引物和探针序列参见表1：

15、

16、

17、

18、本发明的第四方面提供包含所述引物和/或所述探针的检测试剂或检测试剂盒。

19、本发明的第五方面提供一种用于肾功能损伤诊断或复发监控的诊断试剂盒，包括尿液样本采集试剂盒、rna提取试剂盒和如第四方面所述的检测试剂盒

20、本发明的第六方面用于提供与所述测试试剂盒配套的反转录体系和rt-pct反应体系，所述反应体系如下：

21、反转录反应体系：

22、 试剂 使用量 5×gdna eraser buffer 2.0μl gdna eraser 1.0μl total rna 7ul rnase free dh2o 10μl

23、以上试剂来源于takara公司的primescripttm rt reagent kit with gdnaeraser(perfect real time)试剂盒；配制好的反向转录体系以dnase去除其中的dna(42℃2min,转于4℃,短暂低速离心后，置于pcr仪器中，37℃15min，85℃5s后取出备用；

24、所述荧光定量pcr扩增体系为：

25、

26、

27、以上试剂来自takara公司的probeqpcrmix,withung试剂盒。配制好的qpcr扩增体系混合均匀，短暂低速离心后，置于博日荧光定量pcr仪器中，按照如下条件进行扩增：

28、

29、本发明的第七方面提供所述肾功能损伤生物标志物检测试剂盒用于诊断肾功能损伤中的使用方法，包括以下步骤：

30、a)采集受试者的随机尿液样本；

31、b)从所述尿液样本中分离脱落细胞；

32、c)提取所述脱落细胞中的rna；

33、d)检测肾功能损伤相关基因标志物(mrna)的表达水平；

34、e)对所述肾功能损伤相关基因标志物(mrna)的表达水平进行归一化；

35、f)使用逻辑回归模型得到判定分数；以及

36、g)根据判定分数和阈值判断受试者是否患有肾功能损伤或是否复发。

37、进一步地，步骤a)中所述的随机尿液样本为晨尿或者憋尿2小时以上的尿液，尿液量>20ml。

38、进一步地，步骤b)中所述脱落细胞分离方法为低速离心。

39、进一步地，步骤d)中检测标志物表达水平的方法为荧光定量rt-pcr法。

40、本发明的第八方面提供一种电子设备，包括处理器和存储器，所述存储器存储有多条指令，所述处理器用于读取所述指令并执行如第七方面所述的方法。

41、本发明的第九方面提供一种计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质存储有多条指令，所述多条指令可被处理器读取并执行如第七方面所述的方法。