一种姬松茸抗氧化肽的制备方法

本发明涉及生物工程，具体涉及一种姬松茸抗氧化肽的制备方法。

背景技术：

1、机体的氧化应激是许多疾病如糖尿病、癌症和炎症疾病的诱因，此外，脂质氧化会引起很多食物的变质。自由基介导的氧化应激、脂质氧化引起了广泛的关注，寻找可以显著抑制氧化反应的抗氧化剂成为研究的热点。由于一些合成抗氧化剂，如丁基羟基苯甲醚、丁基羟基甲苯、没食子酸丙酯和叔丁基对苯二酚过量添加会产生毒副作用，开发安全有效的天然抗氧化剂具有重要的研究意义

2、抗氧化肽一般由2个～20个氨基酸组成，能够延缓或防止食物系统中的脂质和蛋白质氧化，并保护身体免受与炎症、癌症和衰老等疾病相关的氧化损伤。多肽及蛋白质酶解物具有低致敏性、高活性、易吸收和安全等特点，相较于蛋白质更有益于人体健康。抗氧化肽通常存在于无活性或活性较低的大分子蛋白中，可以通过蛋白酶的酶解制备。酶法制备抗氧化肽反应条件温和、制备效率高，是目前常用的方法。

3、姬松茸(volvariella volvacea)，姬松茸又名巴西蘑菇，是一种极具营养价值的食药兼用菌，姬松茸富含多糖、蛋白质、氨基酸、维生素、甾醇化合物与多酚化合物等多种营养成分，国内外学者研究发现其活性成分有防治糖尿病、抗氧化、抗癌、抗衰老等多种作用，在欧洲、美国、日本等地陆续有与姬松茸相关的保健食品被开发并上市，姬松茸的营养和保健价值日益受到人们的肯定和关注。干姬松茸中含粗蛋白40％～50％，以姬松茸为原料制备活性肽的研究少见报道。蛋白水解产物的抗氧化活性取决于蛋白质来源、蛋白酶类型，水解条件等，因此选择合适的条件水解蛋白具有重要的意义。

技术实现思路

1、发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种工艺简单、酶解效率高、便于工业化生产的姬松茸抗氧化肽的制备方法，解决了合成抗氧化剂吸收后对人体有毒副作用，现有天然抗氧化剂种类少、工艺复杂、产品抗氧化活性较低等问题。

2、技术方案：为了实现上述目的，本发明提供一种姬松茸抗氧化肽的制备方法，具体包括如下步骤：

3、(1)将干燥后的姬松茸过筛，加去离子水混匀，离心取上清液、静置，再离心，取出蛋白，冷冻干燥，得姬松茸蛋白粉；

4、(2)将步骤(1)得到的姬松茸蛋白粉溶于水中，加入蛋白酶，加热后得到酶解液；

5、(3)将步骤(2)得到的酶解液冷却后离心，取上清液，获得抗氧化肽液，对产物进行超滤分离，收集抗氧化肽组分，再进行真空冷冻干燥后，获得粗姬松茸抗氧化肽；

6、(4)将步骤(3)得到的粗姬松茸抗氧化肽用水溶解，然后分离纯化，再进行真空冷冻干燥后获得姬松茸抗氧化肽。

7、进一步地，步骤(1)姬松茸与去离子水的质量体积比为1:7-11g/ml。

8、作为优选，所述步骤(1)姬松茸与去离子水的质量体积比为1:10g/ml。

9、进一步地，所述步骤(2)蛋白酶为木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶中的任意一种。

10、进一步地，所述步骤(2)姬松茸蛋白粉与水的质量体积比为1∶18-22g/ml。

11、作为优选，步骤(2)姬松茸蛋白粉与水的质量体积比为1∶20g/ml。

12、进一步地，所述步骤(2)中加酶量为4000-8000u/g，ph为5.5-7.5，水浴温度为45-65℃，水浴时间为1.5-3.5h。

13、作为优选，步骤(2)中加酶量为6000u/g、ph7.0、酶解温度55.0℃、酶解时间2.5h。

14、进一步地，所述步骤(3)超滤膜截留分子量为3-10kda。

15、作为优选，所述步骤(3)超滤膜截留分子量为3kda。

16、进一步地，所述步骤(4)抗氧化肽溶液浓度为28-35mg/ml。

17、作为优选，步骤(4)抗氧化肽溶液浓度为30mg/ml。

18、进一步地，所述步骤(4)抗氧化肽分离纯化的方法为：将步骤(3)的粗抗氧化肽组分溶解，洗脱层析柱，真空冷冻干燥后，得姬松茸抗氧化肽。

19、其中，所述洗脱层析柱的方法为：将sephadex g25葡聚糖凝胶装成玻璃层析柱，然后用蒸馏水洗脱3个柱体积，每次上样量3-6ml，上样浓度9-11mg·ml-1，用去离子水以05-1.3ml/min的流速洗脱，每5ml收集一管，洗脱液在280nm处测定吸光度值，收集合并后，真空冷冻干燥后，得姬松茸抗氧化肽。

20、作为优选，所述洗脱层析柱的方法为：将sephadex g25葡聚糖凝胶装成玻璃层析柱，然后用蒸馏水洗脱3个柱体积，每次上样量5ml，上样浓度10mg·ml-1，用去离子水以1.0ml/min的流速洗脱，每5ml收集一管，洗脱液在280nm处测定吸光度值，收集合并后，真空冷冻干燥后，得姬松茸抗氧化肽。

21、其中，所述步骤(3)或步骤(4)真空冷冻干燥方法为：将含有抗氧化肽组分置于真空旋转蒸发器中，浓缩至初始体积的1/4-1/3，冷却，分装于冷冻盘中，预冻，然后移至真空冷冻干燥机中冻干。

22、作为优选，所述步骤(3)或步骤(4)真空冷冻干燥方法为：将含有抗氧化肽组分置于真空旋转蒸发器中，浓缩至初始体积的1/3，冷却，分装于冷冻盘中，预冻，然后移至真空冷冻干燥机中冻干。

23、进一步地，真空冷冻的冻干时间为8-12h。

24、作为优选，真空冷冻的冻干时间为10h。

25、本发明以姬松茸为原料，首先提取姬松茸蛋白，然后采用蛋白酶酶解法配合超滤、凝胶层析制备一种抗氧化活性肽。首先从五种蛋白酶中筛选出最佳酶，在筛选完成后，通过单因素实验与响应面优化法对酶解制备抗氧化肽的工艺进行优化，再对最佳条件下制备的多肽进行超滤，对不同分子量的多肽进行dpph自由基清除率试验后，得到抗氧化活性最高的多肽，采用g25葡聚糖凝胶进一步分离，对分离所得的组分中抗氧化活性最高的组分，采用氨基酸自动分析仪对姬松茸抗氧化肽氨基酸测序。

26、本发明制备抗氧化肽工艺对姬松茸中的优质蛋白进行了提取、分离、酶解、超滤、浓缩、冻干等研究，获得了一种姬松茸抗氧化肽，其dpph清除率可达80～90％，提高了姬松茸的产品附加值。

27、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

28、(1)本发明采用酶法制备的原料为姬松茸抗氧化肽，反应条件温和，原料成本低，工艺简单，易于放大生产。

29、(2)采用超滤法对抗氧化肽进行分离纯化，通过多次试验确定分子量小于3kda的抗氧化肽抗氧化活性最强。

30、(3)本发明姬松茸抗氧化肽纯度高，抗氧化肽活性高，其dpph清除率可达80～90％，可被广泛应用于保健食品、化妆品和医药品等领域中。

技术特征：

1.一种姬松茸抗氧化肽的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的姬松茸抗氧化肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)姬松茸与去离子水的质量体积比为1:7-11g/ml。

3.根据权利要求1所述的姬松茸抗氧化肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)蛋白酶为木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的姬松茸抗氧化肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)姬松茸蛋白粉与水的质量体积比为1∶18-22g/ml。

5.根据权利要求1所述的姬松茸抗氧化肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中加酶量为4000-8000u/g，ph为5.5-7.5，水浴温度为45-65℃，水浴时间为1.5-3.5h。

6.根据权利要求1所述的姬松茸抗氧化肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)超滤膜截留分子量为3-10kda。

7.根据权利要求1所述的姬松茸抗氧化肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)抗氧化肽溶液浓度为28-35mg/ml。

8.根据权利要求1所述的姬松茸抗氧化肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)抗氧化肽分离纯化的方法为：将步骤(3)的粗抗氧化肽组分溶解，洗脱层析柱，真空冷冻干燥后，得姬松茸抗氧化肽。

9.根据权利要求8所述的姬松茸抗氧化肽分离纯化的方法，其特征在于，所述洗脱层析柱的方法为：将sephadex g25葡聚糖凝胶装成玻璃层析柱，然后用蒸馏水洗脱3个柱体积，每次上样量3-6ml，上样浓度9-11mg·m l-1，用去离子水以05-1.3ml/min的流速洗脱，每5ml收集一管，洗脱液在280nm处测定吸光度值，收集合并后，真空冷冻干燥后，得姬松茸抗氧化肽。

10.根据权利要求1所述的姬松茸抗氧化肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)或步骤(4)真空冷冻干燥方法为：将含有抗氧化肽组分置于真空旋转蒸发器中，浓缩至初始体积的1/4-1/3，冷却，分装于冷冻盘中，预冻，然后移至真空冷冻干燥机中冻干。

11.根据权利要求10所述的姬松茸抗氧化肽真空冷冻干燥方法，其特征在于，所述冻干时间为8-12h。

技术总结
本发明公开了一种姬松茸抗氧化肽的制备方法，具体包括：将干燥后的姬松茸粉碎过筛，加去离子水混匀，离心取上清液、调节pH值，静置，再离心，取出蛋白，冷冻干燥，得姬松茸蛋白粉；将姬松茸蛋白粉溶于水中，加入蛋白酶，加热后得到酶解液；将酶解液冷却后离心，取上清液，获得抗氧化肽液，对产物进行超滤分离，收集抗氧化肽组分，再进行真空冷冻干燥后，获得粗姬松茸抗氧化肽；将粗姬松茸抗氧化肽用水溶解，然后分离纯化，再进行真空冷冻干燥后获得姬松茸抗氧化肽。本发明采用酶法制备的原料为姬松茸抗氧化肽，反应条件温和，原料成本低，工艺简单；采用超滤法对抗氧化肽进行分离纯化，分子量小于3KDa的抗氧化肽抗氧化活性最强。

技术研发人员：尹秀莲,张浩,沈瀚文,卢聪,游庆红,罗楚平,王小花,李可然,张文强,阚国营
受保护的技术使用者：淮阴工学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15