本发明涉及病毒学领域，具体地，本发明涉及对sars-cov-2的n蛋白、m蛋白、e蛋白和/或部分orf1ab基因组rna进行改造，并基于所述改造提供了制备冠状病毒vlp的方法。此外，本发明还提供了基于所述方法制备的冠状病毒vlp，以及所述vlp的用途。
背景技术：
：：1、复制缺陷型sars-cov-2病毒样颗粒(vlp)假病毒是包含新冠病毒4种结构蛋白(s蛋白,spike protein；m蛋白,membrane glycoprotein；e蛋白,envelope protein；n蛋白,nucleocapsid phosphoprotein)并通过自我组装，通过一段orf1ab的rna与n蛋白的结合将外源基因带入到病毒颗粒内的类似于真病毒的具有感染性的病毒样颗粒，由于orf1ab只有部分片段rna所以病毒样颗粒不具有复制的能力，所以病毒样颗粒只有一轮的感染力，操作比较安全；且病毒样颗粒包含所有新冠病毒的结构蛋白，与仅含有s蛋白的vsv体系的假病毒比较更加接近于活病毒的状态，结构更加稳定。2、复制缺陷型sars-cov-2病毒样颗粒假病毒主要通过多质粒共转染293t细胞，在细胞内自行表达组装形成，通过收集培养基上清方法获得。病毒样颗粒假病毒不仅具备和活病毒一样的感染性，进入细胞的过程和活病毒一样，而且进入细胞后不具有复制产生病毒的能力，因而没有危害，可以更安全地用于中和抗体和抗病毒药物检测以及对新冠病毒结构基因改变对感染性影响的研究。3、sars-cov-2传染性强、致病性强，活病毒研究有极大的危险性，而且数量有限，病毒样颗粒假病毒安全性高，并可以通过转染技术大量制备，为sars-cov-2病毒研究提供了方便。4、sars-cov-2病毒样颗粒假病毒的特点是克服了传统方法的缺陷，使检测技术更安全、简便、快速、高通量，而且使一些本身很难培养的病毒也能采用培养的方法进行检测。但是通常利用sars-cov-2病毒4种结构蛋白直接用于病毒样颗粒假病毒的构建时，其制备的vlp的病毒滴度往往较低，这限制了病毒样颗粒假病毒的应用。因此，亟需进一步提高病毒样颗粒假病毒的病毒滴度。技术实现思路1、本技术的发明人通过大量实验和反复摸索，研究获得了多种能够显著提高vlp滴度的方法：2、(i)发明人通过对sars-cov-2n蛋白进行单点突变实验发现能够提高病毒滴度的关键突变位点，并进一步将n蛋白进行联合突变和密码子优化，因此获得了滴度得到进一步提高的sars-cov-2病毒样颗粒假病毒。3、(ii)发明人对m&e基因进行替换改造后，意外发现将sars-cov-2m&e基因替换为sars-cov-1的m&e基因同样可以提高病毒样颗粒假病毒的滴度。4、(iii)发明人对sars-cov-2orf1ab的部分rna进行截短改造并用于vlp制备，发现特定的截短体可显著提高vlp滴度。5、在此基础上，发明人联合上述(i)至(iii)进行vlp的制备，获得的vlp整体滴度相比传统方法可提高约200倍以上。6、此外，发明人将新型冠状病毒突变株的s基因替换为其它3种人的冠状病毒229e、nl63、sars以及sarbecovirus clade 1a的和sarbecovirus clade 1b的另外21种冠状病毒的s基因，均可利用上述方法包装出病毒样颗粒假病毒。7、可利用本技术方法制备相应vlp的示例性sars-cov-2包括但不限于：wuhan hu-1株，b.1株，b.1.1.7株，b.1.351株，p.1株，b.1.671.2株，ba.1株，ba.2株，ba.3株，ba.4/5株，ba.2.12.1株。8、可利用本技术方法制备相应vlp的除sars-cov-2之外的示例性冠状病毒包括但不限于：229e、nl63、sars、sin852、gz-c、sino1-11、urbani、hgz8l1-a、gd01、pc4-127、pc4-13、pc4-137、gd03t0013、gz0402、sz1、lyra11、wiv1、rs7327、rs4231、rsshc014、rs4084、ratg13、pangolin_gd(1/2019)、pangolin_gx(p5l)。9、因此，在一方面，本技术提供了一种冠状病毒病毒样颗粒(vlp)，其包含源自sars-cov-2的n蛋白的突变体，其中，与对应野生型n蛋白相比，所述n蛋白突变体包含选自以下的一个或多个突变：10、(i)在对应于seq id no:1的第199位氨基酸残基的位置的残基(例如p残基)被置换为l残基；11、(ii)在对应于seq id no:1的第202位氨基酸残基的位置的残基(例如s残基)被置换为r残基；12、(iii)在对应于seq id no:1的第203位氨基酸残基的位置的残基(例如r残基)被置换为m残基。13、在某些实施方案中，所述n蛋白突变体包含突变(i)和(ii)，或者，所述n蛋白突变体包含突变(i)、(ii)和(iii)。14、在某些实施方案中，所述vlp不具备自主复制能力。15、在某些实施方案中，所述源自sars-cov-2的野生型n蛋白具有如seq id no:1所示的氨基酸序列。16、在某些实施方案中，所述n蛋白突变体具有选自seq id no:2-7任一项所示的氨基酸序列。17、在某些实施方案中，所述vlp进一步包含：包含包装信号序列的rna分子；其中，所述包装信号序列选自源自sars-cov-2的ps9区或其截短体，其中，与所述ps9区相比，所述截短体在ps9区3’端截短了110-140个(例如，110-130个、110-126个、120-140个、126-140个、126-130个、120-130个、126个)核苷酸残基。18、在某些实施方案中，所述包装信号序列选自所述ps9区截短体。19、在某些实施方案中，与ps9区相比，所述截短体在ps9区3’端截短了126个核苷酸残基。20、在某些实施方案中，所述ps9区具有如seq id no:12所示的核苷酸序列。21、在某些实施方案中，所述ps9区的截短体具有如seq id no:13所示的核苷酸序列。22、在某些实施方案中，所述vlp进一步包含：m蛋白和e蛋白；其中，所述m蛋白和e蛋白选自源自sars-cov-2或sars-cov-1的m蛋白和e蛋白。23、在某些实施方案中，所述m蛋白和e蛋白选自源自sars-cov-1的m蛋白和e蛋白。24、在某些实施方案中，所述源自sars-cov-2的m蛋白具有如seq id no:8所示的氨基酸序列。25、在某些实施方案中，所述源自sars-cov-2的e蛋白具有如seq id no:10所示的氨基酸序列。26、在某些实施方案中，所述源自sars-cov-1的m蛋白具有如seq id no:9所示的氨基酸序列。27、在某些实施方案中，所述源自sars-cov-1的e蛋白具有如seq id no:11所示的氨基酸序列。28、在某些实施方案中，所述vlp进一步包含：s蛋白；其中，所述s蛋白选自源自冠状病毒的s蛋白。29、在某些实施方案中，所述冠状病毒选自人冠状病毒(例如，sars-cov-2、229e、nl63、sars-cov-1)、sarbecovirus clade 1a(sars-cov-1样冠状病毒)和sarbecovirusclade 1b(sars-cov-2样冠状病毒)。30、在某些实施方案中，所述冠状病毒选自sars-cov-2(例如，omicron系列株)、229e、nl63、sars-cov-1、sin852、gz-c、sino1-11、urbani、hgz8l1-a、gd01、pc4-127、pc4-13、pc4-137、gd03t0013、gz0402、sz1、lyra11、wiv1、rs7327、rs4231、rsshc014、rs4084、ratg13、pangolin_gd(1/2019)、pangolin_gx(p5l)。31、在某些实施方案中，所述sars-cov-2选自wuhan hu-1株，b.1株，b.1.1.7株，b.1.351株，p.1株，b.1.671.2株，ba.1株，ba.2株，ba.3株，ba.4/5株，ba.2.12.1株。32、在某些实施方案中，所述源自冠状病毒的s蛋白具有选自seq id no:14-45所示的氨基酸序列。33、在某些实施方案中，所述vlp包含以下或由其组成：34、(1)如上文中定义的n蛋白突变体；35、(2)如上文中定义的s蛋白；36、(3)如上文中定义的包含ps9区截短体的rna分子；37、(4)如上文中定义的源自sars-cov-1的m蛋白和e蛋白。38、在某些实施方案中，所述包含包装信号序列的rna分子进一步包含报告蛋白的编码序列；在某些实施方案中，所述报告蛋白选自荧光素酶、荧光蛋白。39、在某些实施方案中，所述rna分子进一步包含荧光素酶的编码序列。在某些实施方案中，所述荧光素酶的氨基酸序列如seq id no:46所示。40、在另一方面，本技术还提供了分离的核酸分子，其包含编码n蛋白突变体的核苷酸序列，其中，所述n蛋白突变体如上文中所定义。41、在某些实施方案中，所述分离的核酸分子进一步包含：如上文中定义的s蛋白的编码序列；如上文中定义的包含包装信号序列的rna分子的编码序列；和/或，如上文中定义的m蛋白和e蛋白的编码序列。42、在某些实施方案中，所述分离的核酸分子包含：如上文中定义的n蛋白突变体的编码序列；如上文中定义的s蛋白的编码序列；如上文中定义的包含ps9区截短体的rna分子的编码序列；以及，如上文中定义的源自sars-cov-1的m蛋白和e蛋白的编码序列。43、在另一方面，本技术还提供了载体，其包含如上所述的分离的核酸分子。44、在另一方面，本技术还提供了一种载体系统，所述载体系统包含一个或多个载体，其中，所述一个或多个载体包含：45、(1)n蛋白突变体的编码序列，所述n蛋白突变体如上文中定义；46、(2)s蛋白的编码序列，所述s蛋白如上文中定义；47、(3)包含包装信号序列的rna分子的编码序列，所述rna分子如上文中定义；48、(4)m蛋白和e蛋白的编码序列，所述m蛋白和e蛋白如上文中定义。49、在某些实施方案中，(3)所述的编码序列即为所述rna分子的dna表示形式。50、在某些实施方案中，(3)所述的序列为包含ps9区的rna分子的编码序列。在某些实施方案中，所述ps9区的dna序列如seq id no:52所示。51、在某些实施方案中，(3)所述的序列为包含ps9区截短体的rna分子的编码序列。在某些实施方案中，所述ps9区截短体的dna序列如seq id no:53所示。52、在某些实施方案中，(4)所述的序列为源自sars-cov-1的m蛋白和e蛋白的编码序列。53、在某些实施方案中，(3)中所述序列位于第一载体，(1)、(2)和(4)中所述序列位于另外的一个或多个载体。54、在某些实施方案中，(3)中所述序列位于第一载体，(1)和(2)中所述序列分别位于第二载体和第三载体，(4)中所述m蛋白编码序列和所述e蛋白编码序列共同位于第四载体。55、在某些实施方案中，(4)中所述m蛋白编码序列和所述e蛋白编码序列之间通过ires的编码序列相连。56、在某些实施方案中，所述ires的编码序列如seq id no:47所示。57、在某些实施方案中，所述包含包装信号序列的rna分子进一步包含报告蛋白的编码序列；在某些实施方案中，所述报告蛋白选自荧光素酶、荧光蛋白。58、在某些实施方案中，所述rna分子进一步包含荧光素酶的编码序列。在某些实施方案中，所述荧光素酶的氨基酸序列如seq id no:46所示。59、在另一方面，本技术还提供了宿主细胞，其包含如上所述的载体系统。60、在另一方面，本技术还提供了制备冠状病毒vlp的方法，其包括：在允许所述vlp表达的条件下，培养如上所述的宿主细胞；和，回收所表达的vlp。61、在某些实施方案中，所述方法包括：将如上所述的载体系统引入宿主细胞并培养，回收所述宿主细胞的培养上清中的vlp。62、在另一方面，本技术还提供了如上所述的载体系统或宿主细胞用于制备冠状病毒vlp的用途。63、在另一方面，本技术还提供了如上所述的冠状病毒vlp用于筛选药物或检测抗体活性(例如，结合活性和/或中和活性)的用途。64、在某些实施方案中，所述药物为抑制冠状病毒感染的药物。65、在某些实施方案中，所述抗体为针对冠状病毒的抗体。66、在另一方面，本技术还提供了检测抗体中和活性的方法，其包括：67、(1)将包含待测抗体的样品与如上所述的vlp接触；68、(2)将步骤(1)的产物与细胞接触，所述细胞能够被冠状病毒感染；和，69、(3)检测所述细胞的感染率，从而评价所述待测抗体的中和活性。70、在某些实施方案中，所述抗体为针对冠状病毒的抗体。71、在某些实施方案中，所述vlp包含报告蛋白的编码序列。72、在某些实施方案中，步骤(3)中，通过所述报告蛋白在所述细胞中的表达检测所述细胞的感染率。73、在某些实施方案中，所述报告蛋白选自荧光素酶、荧光蛋白。74、在某些实施方案中，所述方法具备选自以下的一项或多项：75、(a)所述细胞为表达ace2和furin的细胞；在某些实施方案中，所述细胞为表达ace2和furin的293t细胞；76、(b)步骤(2)中，所述步骤(1)的产物与细胞接触的时间为15-22h(例如，15-20h、15-18h、18-22h、18-20h、18h)；77、(c)步骤(1)中，所述vlp的接种量为512-65610tcid50。78、术语定义79、在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的病毒学、生物化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。80、当本文使用术语“例如”、“如”、“诸如”、“包括”、“包含”或其变体时，这些术语将不被认为是限制性术语，而将被解释为表示“但不限于”或“不限于”。81、除非本文另外指明或根据上下文明显矛盾，否则术语“一个”和“一种”以及“该”和类似指称物在描述本发明的上下文中(尤其在以下权利要求的上下文中)应被解释成覆盖单数和复数。82、如本文所用，术语“病毒样颗粒”或“vlp”是指非复制性自组装生物分子。vlp通常由一种或多种病毒蛋白组成，例如但不限于被称作衣壳蛋白、外壳蛋白、壳蛋白、表面蛋白和/或包膜蛋白的诸类蛋白，或衍生自上述蛋白的多肽。通常而言，vlp具有感染性但不含有完整的病毒核酸，从而不具备完全的复制能力。83、本领域技术人员理解，在n蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加，例如不同型别冠状病毒的n蛋白)，而不影响其生物学功能。例如，在不同冠状病毒毒株中，n蛋白的氨基酸序列可天然存在差异(突变或变异)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“野生型n蛋白”应包括所有此类序列，包括例如seq id no：1所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述野生型n蛋白的序列片段或氨基酸位置时，其不仅包括seq id no：1的序列片段或氨基酸位置，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段或氨基酸位置。84、根据本发明，例如，当表述“在对应于seq id no:1的第199位氨基酸残基的位置”是指，当对序列与seq id no:1进行最优比对时，即当序列与seq id no:1进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中与seq id no:1的第199位氨基酸残基位于等同位置的氨基酸残基。例如，当表述“在对应于seq id no:1的第202位氨基酸残基的位置”是指，当对序列与seq id no:1进行最优比对时，即当序列与seq id no:1进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中与seq id no:1的第202位氨基酸残基位于等同位置的氨基酸残基。例如，当表述“在对应于seq id no:1的第203位氨基酸残基的位置”是指，当对序列与seq id no:1进行最优比对时，即当序列与seq id no:1进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中与seq id no:1的第203位氨基酸残基位于等同位置的氨基酸残基。其余以类似表述定义的氨基酸残基的位置的确定方式与此类似。85、如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个dna分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，dna序列ctgact和caggtt共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如align程序(dnastar,inc.)方便地进行的needleman等人(1970)j.mol.biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入align程序(版本2.0)的e.meyers和w.miller(comput.applbiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用pam120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入gcg软件包(可在www.gcg.com上获得)的gap程序中的needleman和wunsch(j moibiol.48:444-453(1970))算法，使用blossum 62矩阵或pam250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。86、本领域技术人员易于理解，本文所述“s蛋白”所源自的冠状病毒不受限制。例如，所述s蛋白可源自天然产生的冠状病毒，或者，所述s蛋白可以是在源自天然冠状病毒的s蛋白的基础上人工引入突变或变异获得的s蛋白。所述s蛋白所源自的冠状病毒包括但不限于：sars-cov-2(wuhan hu-1株，b.1株，b.1.1.7株，b.1.351株，p.1株，b.1.671.2株，ba.1株，ba.2株，ba.3株，ba.4/5株，ba.2.12.1株)、229e、nl63、sars、sin852(例如，如genbank:sin852_ay559082)、gz-c(例如，如genbank:gz-c_ay394979)、sino1-11(例如，如genbank:sino1-11_ay485277)、urbani(例如，如genbank:urbani_ay278741)、hgz8l1-a(例如，如genbank:hgz8l1-a_ay394981)、gd01(例如，如genbank:gd01_ay278489)、pc4-127(例如，如genbank:pc4-127_ay613951)、pc4-13(例如，如genbank:pc4-13_ay613948)、pc4-137(例如，如genbank:pc4-137_ay627045)、gd03t0013(例如，如genbank:gd03t0013_ay525636)、gz0402(例如，如genbank:gz0402_ay613947)、sz1(例如，如genbank:sz1_ay304489)、lyra11(例如，如genbank:lyra11_kf569996)、wiv1(例如，如genbank:wiv1_kf367457)、rs7327(例如，如genbank:ky417151.1)、rs4231(例如，如genbank:ky417146.1)、rsshc014(例如，如genbank:kc881005)、rs4084(例如，如genbank:rs4084_ky417144)、ratg13(例如，如gisaid:epi_isl_402131)、pangolin_gd(1/2019)(例如，如gisaid:epi_isl_410721)、pangolin_gx(p5l)(例如，如gisaid:epi_isl_410540)。87、本文示出的n蛋白、s蛋白、m蛋白、e蛋白的氨基酸序列在其n端包含起始密码子(如atg)编码的氨基酸(如甲硫氨酸(met))。在某些实施方案中，本发明的n蛋白、s蛋白、m蛋白、e蛋白各自独立地不仅囊括在其n末端包含起始密码子编码的氨基酸(如met)的氨基酸序列，也囊括在其n末端不包含起始密码子编码的氨基酸(如met)的氨基酸序列。因此，在上述氨基酸序列的n端不包含起始密码子编码的氨基酸(如met)的序列也在本发明的保护范围内。88、如本文所用，术语“ps9区”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是触发sars-cov-2的rna包装的顺式作用元件。可参见例如，syed am,et al.rapid assessment ofsars-cov-2-evolved variants using virus-like particles.science.2021；374(6575):1626-1632。通常，ps9区指sars-cov-2基因组中在对应于wuhan hu-1株基因组(genbank:nc_045512.2)位置20080-21171的核酸片段。89、如本文中所使用的，术语“载体”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。90、本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，immunology-asynthesis(2nd edition,e.s.golub and d.r.gren,eds.,sinauer associates,sunderland,mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用a或ala表示。91、发明的有益效果92、相比于现有技术公开的方法，本技术提供的制备冠状病毒vlp的方法能够显著提高vlp的病毒滴度，并且，所述方法可普遍适用于多种冠状病毒vlp的制备，例如，可普遍适用于人冠状病毒(例如，sars-cov-2、229e、nl63、sars-cov-1)、sarbecovirus clade 1a(sars-cov-1样冠状病毒)和sarbecovirus clade 1b(sars-cov-2样冠状病毒)。此外，利用本技术提供的方法还能够制备获得通过现有技术手段较难获得的omicron系列vlp。93、由本技术方法制备获得的冠状病毒vlp的滴度高，感染性强，能够有利应用于冠状病毒感染抑制药物的筛选以及抗体活性的检测(例如，结合活性和/或中和活性)。94、下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。当前第1页12当前第1页12