CENP-B结合蛋白、其制备方法和应用与流程

本发明涉及抗体，尤其是涉及一种cenp-b结合蛋白、其制备方法和应用。

背景技术：

1、着丝粒蛋白b(cenp-b)主要位于着丝粒的中心结构域，相对分子质量约80kd，是由不含内含子单一拷贝基因编码的2.9kb mrna的产物，属于螺旋-环-螺旋家族的dna结合蛋白，能特异地与α-卫星dna中高度重复的17bp核苷酸序列(称为cenp-b盒)结合。

2、1980年首次发现局限性系统性硬化症(crest综合症)患者血清可以和染色体上的着丝粒结合，免疫荧光显示出中期细胞成对的着丝粒斑点，说明crest综合症病人血清中含有抗着丝粒蛋白的抗体(anti-centromere autoantibody，aca)。进行性系统性硬皮病(progressive systematic sclerosis，pss)是常见的自身免疫性疾病，在患病人群体中有一类发生变异，临床主要表现为钙质沉着(calcinosis)，雷诺现象(raynaud phenomenon)、食管运动失调(esophageal dysmobility)、趾指硬化病(sclerodactyly)、毛细血管扩张性变异(talangiactasia)等症状，这些症状的字头字母构成的“crest”一词就是这种局限性系统性硬化症名称的由来。crest综合症在pss中属于症状较为轻缓、存活期较长的一个变异类型，对其早期诊断并与其他类型进行区分具有重要的临床应用价值。近年来，很多文献报道acas可见于多种疾病，除系统性硬化症、干燥综合症(ss)、系统性红斑狼疮(sle)、类风湿关节炎(ra)外，还多见于重叠综合症、原发性胆汁肝硬化、重症肌无力、parrg-romberg综合症(帕-罗综合征)、grave病(毒性弥漫性甲状腺肿)、buerger’s病(血栓闭塞性动脉炎)、白癜风以及不明原因的肝硬化、硬化性胆管炎等。对aca阳性患者早期发现、长期随诊、警惕肝、肺损害并及早给予治疗是非常重要的。aca识别的着丝粒蛋白(centromere proteins，cenps)主要有cenp-a、cenp-b和cenp-c等，而其中cenp-b能被大多数的aca识别，这为建立一种快速的临床诊断方法提供了重要的理论依据。

3、抗着丝粒抗体是crest综合症的特异性抗体，阳性率可达50％～80％；同时也见于sle、ra和ss等结缔组织病，但阳性率小于5％。因此制备出高亲和力的抗cenp-b重组单抗对开发诊断试剂盒具有着重要意义和价值。

4、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供能够特异结合cenp-b、具有良好的结合能力的cenp-b结合蛋白。基于本发明提供的cenp-b结合蛋白，本发明的目的还在于提供其应用。

2、名词定义：

3、在本发明中“结合蛋白”此技术术语是指结合特定抗原的蛋白，其泛指包含互补决定区(cdr区)的一切蛋白及蛋白片段。蛋白及蛋白片段可以为抗体，“抗体”和“全长抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体。抗体的类型可能为igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige和igd。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。蛋白及蛋白片段也可以是包含抗体cdr的一部分或全部的抗原结合片段，其缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸但仍能够特异性结合至抗原。此类片段具生物活性，因为其结合至靶抗原，且可与其他抗原结合分子(包括完整抗体)竞争结合至给定表位。此类片段选自但不限于f(ab’)2、fab’、fab、fv(由vh和vl构成)，scfv(单链抗体，vh和vl之间由一连接肽连接而成)、单域抗体(仅由vh组成)、dsfv(二硫键稳定性fv抗体(disulfide stabilized fv fragments,dsfv))、双特异抗体、纳米抗体和抗体最小识别单位中的任意一种。除上述功能片段外，还包括半衰期已增加的任何片段。

4、cenp-b结合蛋白的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链可变结构域可以被称为“vh”。轻链的可变结构域可以被称为“vl”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区(vl或vh)由被三个称为“互补决定区”或“cdr”的高变区打断的骨架区构成。骨架区和cdr的范围已被精确定义，例如在kabat(参见《免疫重要的蛋白质的序列》((sequences of proteins ofimmunological interest)，e.kabat等)和chothia中。抗体的骨架区，即构成要件轻链和重链的组合的骨架区，起到定位和对齐cdr的作用，所述cdr主要负责与抗原的结合。

5、当在本文中使用时，“骨架区”或“fr”区意味着可变结构域中排除被定义为cdr区域之外的区域。每个可变结构域构架可以被进一步细分成被cdr分隔开的毗邻区域(fr1、fr2、fr3和fr4)。通常情况下，重链和轻链的可变区vl/vh可由以下编号的cdr与fr按如下组合排列连接获得：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。

6、本发明不限制cenp-b结合蛋白的获得方式。在一些可选的实施方式中，细胞携带所述多核苷酸、含有所述载体或能够表达cenp-b结合蛋白。利用编码cenp-b结合蛋白的多核苷酸与载体连接后，在细胞表达能够获得相应cenp-b结合蛋白。可以将上述载体导入到真核细胞、尤其是哺乳动物细胞中，构建获得能够表达所述cenp-b结合蛋白的细胞。在另一些可选的实施方式中，cenp-b结合蛋白还可以通过本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过肽合成，如自动肽合成仪获得(例如applied biosystems等销售的自动肽合成仪)；当cenp-b结合蛋白为抗原结合片段时，还可选地通过抗原结合分子(包括完整抗体)的酶裂解产生，例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶裂解；或化学裂解产生，例如通过化学还原分裂二硫键的方法获得上述的抗原结合片段。

7、术语“特异性识别”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”或其类似表述是指cenp-b结合蛋白对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，cenp-b结合蛋白以大约小于10-6m，例如大约小于10-7m、10-8m、10-9m或10-10m或更小的kd值结合。使用本领域中充分确立的方法可以确定抗体的kd值。用于评价配体诸如抗体对靶标的结合能力的其它标准测定是本领域已知的，包括例如，elisa、蛋白质印迹、ria和流式细胞计量术分析。

8、本文中术语“多核苷酸”指的是任何长度的核苷酸的聚合物形式，多核苷酸包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。多核苷酸的实例包括但不限于单链、双链或多链dna或rna、基因组dna、cdna、dna-rna杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。

9、术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。

10、载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(ires)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚u序列等)。

11、本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。后代可以由于天然的、偶然的或故意的突变不一定与原代细胞完全相同，在形态学上和/或在基因组dna上与原代细胞存在差异。“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物。

12、本文中，与多肽或核酸相关联的术语“纯化的”或“分离的”是指多肽或核酸不是处于其天然介质中或天然形式下。因此，术语“分离的”包括从其原始环境，例如如果它是天然存在的，从天然环境取出的多肽或核酸。例如，分离的多肽通常不含通常与其结合或通常与其混合或在溶液中的至少某些蛋白质或其他细胞组分。分离的多肽包括细胞裂解物中包含的天然生产的所述多肽，纯化或部分纯化形式的所述多肽，重组多肽，被细胞表达或分泌的所述多肽，以及在异源宿主细胞或培养物中的所述多肽。与核酸相关联，术语分离的或纯化的指示例如所述核酸不在其天然的基因组背景中(例如在载体中，作为表达盒，连接到启动子，或人工引入到异源宿主细胞中)。

13、为解决上述技术问题，提供如下示例性实施方案：

14、根据本发明的一个方面，本发明提供了一种cenp-b结合蛋白，其具有重链可变区和/或轻链可变区；

15、所述重链可变区包括互补决定区vh-cdr1、vh-cdr2和vh-cdr3；所述轻链可变区包括互补决定区vl-cdr1、vl-cdr2和vl-cdr3；

16、所述vh-cdr1的氨基酸序列为a-x1-t-f-t-s-x2-p，其中x1为f或w，x2为y或s，如seq id no:1～4所示；

17、所述vh-cdr2的氨基酸序列为i-x3-e-g-x4-v-d-t，其中x3为s或y，x4为g或a，如seq id no:5～8所示；

18、所述vh-cdr3的氨基酸序列为a-x5-g-l-k-g-x6-a-y，其中x5为r或k，x6为f或w，如seq id no:9～12所示；

19、所述vl-cdr1的氨基酸序列为e-n-i-x7-t-n，其中x7为y或s，如seq id no:13或seq id no:14所示；

20、所述vl-cdr2的氨基酸序列为g-x8-t，其中x8为a，氨基酸序列为gat(seq id no:15)；或x8为g，氨基酸序列为ggt(seq id no:16)；

21、所述vl-cdr3的氨基酸序列为q-h-f-x9-t-i-p-x10-t，其中x9为w或f，x10为y或s，如seq id no:17～20所示。

22、所述cenp-b结合蛋白可为全长抗体、f(ab’)2、fab’、fab、fv、scfv、dsfv、双特异抗体、纳米抗体和抗体最小识别单位中的任意一种。

23、作为本发明的优选实施方式，所述cenp-b结合蛋白与cenp-b具有kd≤5.6×10-8mol/l的亲和力。

24、作为本发明的优选实施方式，所述cenp-b结合蛋白包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区中各互补决定区的突变位点选自下述突变组合1～32中的任意一种：

25、

26、

27、作为本发明的优选实施方式，各互补决定区的突变位点选自上表中突变组合1、2、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、21、22、30、31或32；更优选自上表中突变组合1或16。包含突变组合1或16的抗体与cenp-b的kd值小于10-9mol/l。

28、作为本发明的优选实施方式，所述cenp-b结合蛋白还包括骨架区，骨架区的优选氨基酸序列组成如下：重链可变区包括骨架区vh-fr1、vh-fr2、vh-fr3和vh-fr4；

29、vh-fr1的氨基酸序列为evklvesggglvqpggslklscaas(seq id no:21)，

30、vh-fr2的氨基酸序列为mswvrqtpekrlewvay(seq id no:22)，

31、vh-fr3的氨基酸序列为yypdtiegrftisrdnakntlylqmsslksedtamyfc(seq id no:23)，

32、vh-fr4的氨基酸序列为wgqgtlvtvsa(seq id no:24)；

33、重链可变区包括依次排列的如下结构域：vh-fr1、vh-cdr1、vh-fr2、vh-cdr2、vh-fr3、vh-cdr3和vh-fr4。

34、轻链可变区包括骨架区vl-fr1、vl-fr2、vl-fr3和vl-fr4；

35、vl-fr1的氨基酸序列为diqmtqfpaslsvsvgetvtitcrts(seq id no:25)，

36、vl-fr2的氨基酸序列为lawyqqkqgkspqllvs(seq id no:26)，

37、vl-fr3的氨基酸序列为nladgvpsrfsgsgsgtqyslkinnlqsedfgsyyc(seq id no:27)，vl-fr4的氨基酸序列为fgggtkleik(seq id no:28)。

38、轻链可变区包括依次排列的如下的结构域：vl-fr1、vl-cdr1、vl-fr2、vl-cdr2、vl-fr3、vl-cdr3、vl-fr4。

39、作为本发明的优选实施方式，cenp-b结合蛋白为包括恒定区的抗体或抗原结合片段。

40、cenp-b结合蛋白的恒定区可选自igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige和igd任何其中之一恒定区的序列，以及它们的亚类和突变形式。恒定区的种属来源例如可以为但不限于为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。

41、作为本发明的一些可选实施方式，恒定区的种属来源为小鼠。小鼠来源的恒定区的氨基酸序列优选如下：重链恒定区氨基酸序列如seq id no:29所示，轻链恒定区氨基酸序列如seq id no:30所示。

42、作为本发明的一些可选实施方式，恒定区的种属来源为人。优选地，人来源的重链恒定区氨基酸序列如seq id no:31所示，轻链恒定区氨基酸序列如seq id no:32所示。

43、作为本发明的优选实施方式，cenp-b结合蛋白为含有突变组合1的抗体，其重链氨基酸序列如seq id no:33所示，轻链氨基酸序列如seq id no:35所示；或所述cenp-b结合蛋白为含有突变组合16的抗体，其重链氨基酸序列如seq id no:34所示，轻链氨基酸序列如seq id no:36所示。

44、根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种生物材料，包括多核苷酸、载体、细胞；其中，多核苷酸编码上述cenp-b结合蛋白；载体携带所述多核苷酸；细胞携带所述多核苷酸、含有所述载体或能够表达所述cenp-b结合蛋白。利用编码所述cenp-b结合蛋白的多核苷酸与载体连接后，可以将上述载体导入到真核细胞、尤其是哺乳动物细胞中，构建获得能够表达cenp-b结合蛋白的细胞系，在细胞表达能够获得相应蛋白。在一些可选的实施方式中，所述宿主细胞为293f细胞(人胚肾细胞)。

45、根据本发明的另一个方面，本发明还提供了与上述cenp-b结合蛋白的制备方法，包括：将编码含有所述cenp-b结合蛋白的多核苷酸转化至宿主细胞并表达，通过纯化获得cenp-b结合蛋白。

46、作为本发明的一些可选实施方式，根据需要合成含有所述cenp-b结合蛋白编码基因的多核苷酸，和/或，根据需要制备合适的表达载体，将表达载体转化至所需的宿主细胞中并表达，通过纯化可得到所述cenp-b结合蛋白。

47、作为本发明的一些可选实施方式，所述的cenp-b结合蛋白的多核苷酸包括重链基因表达质粒和轻链基因表达质粒，将所述重链基因表达质粒和轻链基因表达质粒按照1：(1～2)的摩尔比转化至宿主细胞，细胞表达后纯化获取所述cenp-b结合蛋白，其中宿主细胞优选为真核细胞，更优选为哺乳动物细胞，进一步优选为293f细胞。

48、根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述cenp-b结合蛋白、上述生物材料在如下(a)～(e)中任意一种的应用；

49、(a)制备检测cenp-b的试剂或试剂盒；

50、(b)制备诊断疾病的试剂或试剂盒，所述疾病包括局限性系统性硬化症、系统性硬化症、干燥综合症、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、重叠综合症、原发性胆汁肝硬化、重症肌无力、parrg-romberg综合症(帕-罗综合征)综合症、grave病(毒性弥漫性甲状腺肿)、buerger’s病(血栓闭塞性动脉炎)、白癜风、肝硬化和硬化性胆管炎中的一种或多种；

51、(c)非诊断和治疗目的的检测cenp-b；

52、(d)用于制备cenp-b抗体检测质控品；

53、(e)制备用于示踪的组合物。

54、根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种试剂或试剂盒，该试剂或试剂盒包含上述cenp-b结合蛋白；和/或，上述生物材料。作为本发明的优选实施方式，所述试剂为质控品或用于示踪的组合物。

55、所述用于示踪的组合物包含所述cenp-b结合蛋白和标记物；所述标记物包括酶、发光标记、荧光微球、彩色微球、乳胶微球、胶体金、量子点、生物素或链霉亲和素、放射性核素、放射性造影剂、顺磁离子、金属和光敏剂中的一种或多种。试剂或试剂盒中用于示踪的组合物中cenp-b结合蛋白和标记物可以连接也可以不连接；当不连接时，若需要连接则待使用时再进行连接。所述连接可以但不限于化学连接或物理吸附。

56、酶的实例例如可以为但不限于为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶，发光标记例如可以为但不限于为荧光蛋白、合成类小分子或聚合物染料等，具体的实例包括但不限于alexa350、alexa 405、alexa430、alexa 488、alexa 555、alexa 647、amca、氨基吖啶、bodipy630/650、bodipy 650/665、bodipy-fl、bodipy-r6g、bodipy-tmr、bodipy-trx、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、cascade blue、cy2、cy3、cy5、cy7、6-fam、丹磺酰氯、荧光素、hex、6-joe、nbd(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、oregon green 488、oregon green 500、oregon green514、pacific blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、la jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin b、藻蓝蛋白c、藻蓝蛋白r、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白r、reg、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、rox、tamra、tet、trit(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的一种或多种。荧光微球、彩色微球和乳胶微球分别独立的选自本领域可接受的产品，例如来源于市售的产品。放射性核素包括但不限于110in、111in、177lu、18f、52fe、62cu、64cu、67cu、67ga、68ga、86y、90y、89zr、94mtc、94tc、99mtc、120i、123i、124i、125i、131i、154-158gd、32p、11c、13n、15o、186re、188re、51mn、52mmn、55co、72as、75br、76br、82mrb和83sr中的一种或多种。顺磁离子包括但不限于铬(iii)、锰(ii)、铁(iii)、铁(ii)、钴(ii)、镍(ii)、铜(ii)、钕(iii)、钐(iii)、镱(iii)、钆(iii)、钒(ii)、铽(iii)、镝(iii)、钬(iii)和铒(iii)中的一种或多种。

57、可以理解的是，本发明提供的试剂或试剂盒中除去上述抗体组合物，以及可选的固相载体，还任选地包括本领域用于检测反应的，本领域技术人员熟知的试剂和/或耗材，例如可以为但不限于为缓冲试剂、盐、二抗、显色底物、封闭液、洗涤液、溶剂、洗脱液、偶联剂、阴性对照、阳性对照、标准品、质控品和标记物中的一种或多种。

58、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

59、本发明cenp-b结合蛋白具有亲和力高的优点，其cenp-b结合的kd值最小可达到1.6×10-9m，在一些优选的抗体中，在多重液相芯片平台评估验证抗体效价，当抗体稀释1000倍以上后读值仍然在1000以上为合格。

60、本发明提供的cenp-b结合蛋白的制备方法具有制备过程高效的优点，将cenp-b结合蛋白不仅可以用于检测样品中的cenp-b，还可以用于制备质控品，本发明抗体生产成本低，特异性好，在避免了鼠单抗随着时间丢失效价的风险的同时，还缓解了使用人血清提取的高成本和产量低的问题，为开发相应诊断试剂盒提供了基础。