一种人SF3B1乙酰化多肽、抗原、抗体及其制备方法和应用

本发明涉及抗体制备，特别涉及一种人sf3b1乙酰化多肽、抗原、抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、新近发布的全球癌症统计数据显示，在所有癌症中，食管癌发病率位于第7位，而死亡率位于第6位，每18名癌症死亡病人中就有1人为食管癌。美国癌症统计数据显示，在所有癌症中食管癌五年生存率已经排在最后5位。由于食管癌早期症状不明显，患者出现症状时一般已处于中、晚期，且中、晚期患者预后较差，严重危害人类健康。食管癌发病率存在明显的地区分布差异，我国是食管癌高发区，各省份中我国的河南省、山西省及河北省为食管癌发病率较高的省份。广东省尤其潮汕地区，也是我国食管癌高发区。食管癌发病因素包括遗传因素、吸烟、酒精、饮食、肥胖等，但发病机制仍不明确，而且早期诊断指标不足，对其进行深入研究有着重要意义。

2、前体mrna剪接是基因表达转录后调节中的一个重要步骤，是一个从前体rna中去除非编码序列(内含子)并连接编码序列(外显子)形成mrna的过程，蛋白质多样性的产生主要是由于前体mrna剪接过程。前体mrna剪接是由剪接体催化，目前发现的剪接体有两种：u2型剪接体和u12型剪接体，他们所识别和作用的内含子不同，但是他们的组成有许多共同的蛋白质。例如，蛋白质复合物sf3b的所有亚单位，即sf3b155/sf3b1、sf3b145、sf3b130、sf3b49、sf3b14a/p14、sf3b14b和sf3b10。sf3b1基因位于染色体2q33.1上，是剪接体因子3b(sf3b)复合体的最大亚单位，是剪接体的核心成分，对于识别和结合靠近3′剪接位点的分支点序列至关重要，并且在准确切除前体mrna的内含子形成成熟mrna中起着重要作用。因此，sf3b1突变会引起多个基因的表达失调，可能是肿瘤发生的驱动因素。

3、临床和实验数据表明，sf3b1突变与肿瘤的发生、发展及转移有关联。在乳腺癌中，sf3b1基因突变会导致细胞丝氨酸合成酶(phgdh)表达下降，影响细胞中丝氨酸的合成代谢，说明sf3b1突变会影响细胞的能量代谢过程。在骨髓增生异常综合征患者中，sf3b1突变的体细胞由于3'剪接位点的错误识别导致移码，产生的异常mrna一部分被降解，未降解的mrna被翻译成了异常功能的蛋白质，导致两个参与线粒体铁代谢的基因ppox和abcb7基因的表达量显著下调。在慢性淋巴细胞白血病中，sf3b1突变会导致多个基因发生3'端异常剪接，包括slc23a2、tc1rg1、foxp等，这些突变剪接因子破坏了b细胞的生长和功能，改变了细胞的发育，引起细胞衰老。还有研究表明，在sf3b1基因突变体中abcc5基因发生内含子保留，abcc5基因的突变与肿瘤的耐药性密切相关。

4、蛋白质乙酰化修饰是指在乙酰基转移酶的作用下将乙酰基转接到蛋白质分子链上的一种蛋白质修饰过程。它属于蛋白质翻译后修饰的一种，包括组蛋白乙酰化和非组蛋白乙酰化，主要发生位点在赖氨酸上。蛋白质乙酰化修饰会影响蛋白质的功能作用的发挥，比如酶的活化与失活、蛋白质稳定性、亚细胞结构定位和特殊功能复合体的形成等。组蛋白中的h3、h4发生乙酰化修饰可以激活基因转录。组蛋白乙酰化除了可以激活特定基因的转录过程外，还是一个可逆的动态调节过程，维持这种可逆的乙酰化过程对于稳定染色质的结构和调控基因表达有着至关重要的作用。非组蛋白乙酰化也参与了与生理学和疾病相关的关键细胞过程，如基因转录、dna损伤修复、细胞分裂、信号转导、蛋白质折叠、自噬和代谢。总之，对非组蛋白乙酰化修饰与肿瘤发生的研究加深了对肿瘤发生机制的认识，对肿瘤的治疗提供了新思路和新靶点。

5、抗体是蛋白质功能研究的重要工具，已被广泛用于肿瘤等疾病诊断、治疗等临床应用中，磷酸化抗体的制备和应用已成为国际上关注的热点。但是目前仍缺乏用来检测人sf3b1蛋白的氨基酸序列中lys866位点乙酰化状态的抗体。

技术实现思路

1、针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种针对sf3b1蛋白k866乙酰化位点的抗原多肽，可特异性识别人肿瘤细胞表达的sf3b1蛋白k866乙酰化位点的多克隆抗体以及其制备方法和应用。

2、本发明提供一种人sf3b1乙酰化多肽，所述人sf3b1乙酰化多肽的序列为eqyrk(acetyl)mvmetiekc，其中k(acetyl)表示人sf3b1蛋白k866位点氨基酸乙酰化赖氨酸。所述抗原多肽为人sf3b1蛋白第866位赖氨酸位点的附近14肽作为候选多肽筛选得到，其中该k866位点的赖氨酸为乙酰化状态，且c端连接一个半胱氨酸的氨基酸序列。

3、本发明还提供一种抗原，所述抗原为所述人sf3b1乙酰化多肽和载体蛋白的偶联物。

4、进一步的，所述载体蛋白选自klh、ova、thy或bsa。

5、本发明还提供一种抗体，所述抗体可特异性结合所述的人sf3b1乙酰化多肽。所述抗体是针对人sf3b1蛋白k866位点氨基酸乙酰化的抗体，其中所述抗体制备中采用了由以下氨基酸序列组成的抗原多肽，其具体序列为：eqyrk(acetyl)mvmetiekc，其中k(acetyl)表示人sf3b1蛋白k866位点氨基酸乙酰化赖氨酸。

6、进一步的，所述抗体选自多克隆抗体或其经过化学手段或酶消化处理后可仍然保持结合所述人sf3b1乙酰化多肽的性质的抗体片段。

7、进一步的，所述多克隆抗体为利用eqyrk(acetyl)mvmetiekc和载体蛋白的偶联物免疫非人动物接着纯化提取所述非人动物的血清后获得的。

8、进一步的，所述抗体可用于人sf3b1蛋白k866乙酰化位点的乙酰化水平检测。

9、本发明还提供所述的抗体的制备方法，包括如下步骤：

10、(1)对sf3b1蛋白第866位点附近赖氨酸序列的二级结构、免疫原性、亲疏水性、表面可及性等进行分析，确定合适的一段多肽序列；人工合成所述的人sf3b1乙酰化多肽；

11、(2)将合成的多肽与马来酰亚氨活化的载体mcklh偶联，将偶联产物进行脱盐柱纯化后免疫非人动物；

12、(3)经过五次免疫的非人动物血清用elisa法对抗体效价进行检测，收集免疫非人动物血清，并用多肽包被的溴化氰活化的琼脂糖亲和纯化柱纯化抗体；

13、(4)对纯化后抗体进行elisa、免疫组化鉴定。

14、本发明还提供所述的人乙酰化sf3b1多肽或所述的抗原或所述的抗体在制备用于肿瘤的诊断、治疗及预后判定的试剂或试剂盒中的应用。所述的癌细胞优选为人食管癌细胞。

15、本发明还提供一种检测试剂盒，包括所述的抗体、抗原修复液、pbs缓冲溶液、内源性过氧化物酶阻断剂、辣根酶标羊抗小鼠/兔igg聚合物、dab显色剂、苏木素染液、乙醇、环保透明剂、0.5％氨水和超纯水。所述抗原修复液为edta(1x)抗原修复液；所述pbs缓冲溶液ph为7.4；所述阻断剂为内源性过氧化物酶阻断剂，如3％h2o2；所述环保透明剂为van-clear环保透明剂。

16、综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

17、(1)本发明采用人工设计和合成含有该乙酰化位点的一段sf3b1蛋白k866位点的抗原多肽，并制备对应的多克隆抗体。该多克隆抗体经过elisa等鉴定可特异性识别sf3b1蛋白k866乙酰化位点，并且相对于癌旁组织其在多种癌组织细胞中高表达，其差异具有统计学意义。

18、(2)本发明是针对人sf3b1蛋白k866位点乙酰化多克隆抗体，有助于研究介导其发生乙酰化的激酶作用，探讨人sf3b1蛋白多种生物学功能。

19、(3)本发明的乙酰化多克隆抗体可特异性识别sf3b1蛋白k866乙酰化位点，可用于检测肿瘤细胞该位点的乙酰化水平，为探索肿瘤细胞增殖及转移机制研究提供一种工具，也为肿瘤诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断。