一种用于制备手性醇化合物的羰基还原酶突变体及其用途的制作方法

本发明属于酶工程和有机合成领域，尤其涉及一种用于制备手性醇化合物的羰基还原酶突变体及其用途。

背景技术：

1、本发明是cn202111154268.7的分案申请。

2、手性双醇类化合物是靶向肝脏药物所使用的关键中间体，已在多个临床及临床前研究药物中使用。例如甲磺酸帕拉德福韦，该肝靶向前药目前由西安新通医药股份有限公司开发，已完成临床二期，目前正在开展临床三期。该关键双醇中间体均采用化学的合成路线。

3、在专利文献us20030225277中报道了制备方法，工艺路线如下：

4、

5、该技术方案需要使用有机催化剂(+)-dipcl，该催化剂价格昂贵，工艺操作繁琐，难以应用于规模化生产。使用该工艺路线制备的双醇化合物的手性纯度为98％，为了满足注册申报要求，需要对其手性纯度进行精制，进一步增加了生产成本，整体路线生产成本较高，因此迫切需要一条满足商业生产的制备方法。

6、现有技术中有很多使用羰基还原酶及其突变体对羰基进行还原的文献。羰基还原酶可以实现羰基的高立体选择性，在制备手性醇方面具有广泛的应用。需要解决的问题主要是高的酶活力和立体选择性。

7、cn112941043公开了一种羰基还原酶及其突变体，可以用于制备手性β’羟基-β-氨基酸；cn112626144a公开了一种用于制备替诺福韦中间体的生物合成方法，使用了羰基还原酶；cn112359028a公开了一种羰基还原酶，是产酶菌株escherichia coli tm1908接种，发酵得到。

8、cn102482648a公开了一种制备α-氯代醇的立体选择性好的酮还原酶。其转化率和立体选择性都高，但是酶活力不足，还不能满足实际需求。特别是工业化大规模制备。

9、cn108753851a公开了一种以羰基还原酶为生物催化剂制备手性单羟基衍生化的的手性醇的方法，其利用的羰基还原酶为chkred12，其在ncbi数据库中的登录号为kc342012。

10、但是利用现有技术中已知的羰基还原酶在还原特定结构的底物时，还存在酶活性不足的情况，并不利于开展大规模的工业化制备。由于的酶的价格都比较昂贵，酶活性严重制约着是否能产业化。

技术实现思路

1、针对现有技术中的羰基还原酶制备手性双醇化合物，特别是帕拉德福韦中间体(s)-1-(3-卤代苯基)-1,3-丙二醇时，存在酶活性不足的缺陷，本发明提出了一种羰基还原酶突变体，其具有更高的酶活性和优异的立体选择性，为(3-卤代苯基)-1,3-丙二醇类的医药中间体的酶合成提供了产业化的便利。

2、本发明第一个目的是提供一种羰基还原酶突变体，是在对应于seq id no：2的氨基酸序列存在下述突变之一或者两种以上的组合：45位的v突变为i(v45i)，63位的k突变为q(k63q)，141位的g突变为a(g141a)，141位的g突变为v(g141v)，195位的i突变为l(i195l)，204位的a突变为v(a204v)。

3、进一步地，所述羰基还原酶突变体，是在对应于seq id no：2的氨基酸序列存在下述突变之一：

4、(i)141位的g突变为a(g141a)，且195位的i突变为l(i195l)，其氨基酸序列如seqid no：4所示；

5、(ii)141位的g突变为v(g141v)，且195位的i突变为l(i195l)，其氨基酸序列如seqid no：6所示。

6、(iii)45位的v突变为i(v45i)；141位的g突变为v(g141v，i195l)，195位的i突变为l(i195l)，其氨基酸序列如seq id no：8所示；

7、(iv)45位的v突变为i(v45i)，141位的g突变为v(g141v，i195l)，195位的i突变为l(i195l)，204位的a突变为v(a204v)，其氨基酸序列如seq id no：10所示；

8、(v)45位的v突变为i(v45i)，63位的k突变为q(k63q)，118位的l突变为m(l118m)，141位的g突变为v(g141v，i195l)，204位的a突变为v(a204v)，其氨基酸序列如seq id no：12所示。

9、seq id no：2的氨基酸序列对应的羰基还原酶来源于novosphingobiumaromaticivorans的羰基还原酶nakred，参考文献cn102482648，发明人通过酶库的筛选，预料不到地发现在对seq id no：2的氨基酸序列的wo03羰基还原酶的特定位点突变为特定氨基酸后得到的突变体，在利用式(iv)底物制备式(v)时，酶活性高，转化率高，立体选择型好。

10、本发明提供的羰基还原酶突变体还包括以下范围：对seq id no:4、6、8、10、或12所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的氨基酸序列；或

11、对seq id no:4、6、8、10、或12所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，在序列的n端或c端进行一个或多个氨基酸的插入，所述插入的氨基酸残基个数为1-20个；优选1-10个，更优选1-5个。

12、对于酶的制备方法，将实现辅酶再生的醇脱氢酶或葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶与目的基因构建在同一质粒pet28a(+)载体上，然后导入表达宿主大肠杆菌，通过诱导表达，获得含有目的酶的菌体。可直接使用离心获得菌体，将其破壁获得粗酶液或粗酶粉，用于后续的生物转化反应。

13、本发明的第二个目的是提供一种手性双醇类化合物的制备方法，包括以下步骤：

14、以式ⅳ化合物为底物，在辅酶存在下，在上述羰基还原酶催化下，进行不对称还原反应，得到式v化合物；

15、

16、其中r基团选自

17、

18、中的至少一种；x选自f、cl、br、i。

19、所述羰基还原酶的加入形式包括菌体、粗酶液、粗酶粉或纯酶。

20、优选地，所述反应体系中，所述底物，即式ⅵ化合物的浓度为50～200g/l；更优选为100～150g/l。

21、优选地，羰基还原酶的用量与底物质量比率优选为1wt％～6wt％，比如当以湿菌体加入时，加入湿菌体的质量与底物的质量比率为30wt％～100wt％，优选50wt％-70wt％。

22、进一步地，所述的反应体系中，还存在共底物，所述的共底物选自下组：异丙醇、葡萄糖、甲酸铵中的至少一种；优选地，共底物的浓度为底物浓度的100-200％，优选共底物的浓度为底物浓度的140-170％。

23、进一步地，制备过程中在磷酸缓冲盐体系中进行，ph为6-9，较佳地6.5-8.5，更佳地7.0-7.5；和/或

24、反应温度为10℃-50℃，较佳地20℃-40℃，更佳地25℃-35℃；和/或

25、反应时间为0.1-240小时，较佳地0.5-120小时，更佳地1-72小时，又更佳地3-10小时。

26、进一步地，所述的辅酶指能够实现氧化还原反应中电子传递的辅酶；包括还原型辅酶、氧化型辅酶中的至少一种；所述还原型辅酶选自nadh、nadph、或其组合；所述氧化型辅酶选自nad+、nadp+或其组合。

27、更进一步地，所述辅酶用量与底物用量比率为0.01wt％～1.0wt％、优选为0.01wt％～0.5wt％。

28、进一步地，所述的反应体系中，羰基还原酶为游离形式的酶、固定化酶、或菌体形式的酶。

29、进一步地，所述羰基还原酶和/或用于辅酶再生的酶的基因构建在表达载体上。

30、进一步地，所述的反应体系中，还存在用于辅酶再生的酶，具体选自醇脱氢酶，甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、或其组合。

31、在本发明的羰基还原酶催化下，式(iv)的底物化合物转变为产物式(v)化合物的转化率在70％以上，优选在85％以上，更优选在95％以上，最优选在99％以上；式v化合物ee值在90％以上，更优选95％以上，更优选在99％以上。

32、在另一优选例中，在步骤(b)中，所述的分离包括：加入异丙醇，离心菌体，部分浓缩，甲叔醚萃取，浓缩有机层。

33、本发明的主要优点在于：

34、(1)本发明适合工业化生产具有高化学纯度和高光学纯度的式v化合物，然后进一步进行后续反应，制备(s)-1-(3-氯苯基)-1,3-丙二醇。

35、(2)本发明方法和催化还原反应体系有高达99.5％的的立体选择性，以及对有机溶剂的高耐受性、对底物的耐受性，高催化活性，底物浓度可达100g/l以上，从而可以在较高的底物浓度下，进行大规模生产。

36、(3)本发明方法与化学合成法相比，显著减少或消除了各类污染性化学品的使用，从而显著降低了环境污染风险。选择了特定的羰基还原酶突变体，酶活性高，立体选择性好，极大地提高生产效率，降低生产成本。本发明方方法后处理仅需萃取操作，操作简单。