一种识别CD276-CAR分子的纳米抗体及其应用的制作方法

本发明属于生物医药，具体涉及一种识别cd276-car分子的纳米抗体及其应用。

背景技术：

1、cd276分子，又称为b7-h3分子，是一种i型跨膜糖蛋白，属于b7免疫共刺激和共抑制家族。b7-h3在正常人体组织中表达水平较低，但在人恶性肿瘤中高度表达，例如胃癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌和乳腺癌等，高表达的蛋白往往与癌症的不良预后密切相关。

2、最近的研究表明，b7-h3在肿瘤的生长、侵袭、迁移及血管生成和转移中起着重要作用，由于其在免疫逃逸中的作用，b7-h3已成为新的免疫治疗靶点。主要免疫治疗手段有：单抗、双抗、小分子、adc药物、car-t治疗等。临床上进展较快的是macrogenics公司的enoblituzumab单抗，及在此单抗基础上改造获得的b7-h3*cd3双抗(mgd009)，b7-h3-adc药物(mgc018)等，daiichi sankyo公司的b7-h3-adc药物(ds-7300a)。联合治疗方面，b7-h3和pd-l1对t细胞产生抑制作用，改变t细胞的微环境以逃避抗肿瘤免疫应答。而b7-h3和ctla4也可能有协同作用，类似于b7-h3在pd-1通路中一样。

3、本领域技术人员还开发了cd276-car-t细胞靶向治疗cd276阳性恶性实体肿瘤的方法，但是，目前尚无一种非常特异的检测cd276-car的方法，无法准确检测cd276-car的转染效率，因此，提供一种能够准确检测car转染效率的抗体，在靶向治疗cd276阳性恶性实体肿瘤中具有重要的意义。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种识别cd276-car分子的纳米抗体及其应用。本发明所述识别cd276-car分子的纳米抗体能够特异性识别cd276-car-t细胞上cd276-car分子，与其他分子无交叉反应；所述识别cd276-car分子的纳米抗体与cd276-car分子的结合活性高，能准确检测car转染效率。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种识别cd276-car分子的纳米抗体，所述纳米抗体的可变区包括如seq id no:4、seq id no:8或seq id no:12所示的cdr3。

4、优选地，所述纳米抗体的可变区包括如seq id no:2、seq id no:6或seq id no:10所示的cdr1。

5、优选地，所述纳米抗体的可变区包括如seq id no:3、seq id no:7或seq id no:11所示的cdr2。

6、优选地，所述纳米抗体包括如seq id no:1、seq id no:5或seq id no:9所示的vhh链。

7、本发明首先合成cd276scfv序列，构建cd276scfv单链抗体表达载体，使用表达的cd276scfv单链抗体免疫美洲无峰驼，采集血清进行效价检测，选取免疫效价较高进行冲击免疫，免疫十天后采集外周血，分离pbmc，提供总的rna，逆转录为cdna后，使用单域抗体扩增引物进行两轮pcr，获得vhh片段，将该片段酶切后亚克隆至噬菌体展示载体pcomf中，电转化ss320大肠杆菌感受态细胞，构建单域抗体噬菌体展示库，对噬菌体展示库多样性进行分析。包被cd276scfv-fc和fc重组蛋白，将构建的噬菌体展示抗体库进行四次淘选，富集阳性克隆，得到识别cd276-car分子的纳米抗体，能够特异性识别cd276-car分子。

8、此外，本领域技术人员还可很方便地获知本发明的抗体的结构，然后可通过重组方法来制备本发明的纳米抗体。本发明中的纳米抗体能够特异性识别cd276-car-t细胞上cd276-car分子，这种特异性的抗体可以用于检测cd276-car-t细胞的转染效率。

9、本发明筛选出了三种纳米抗体(如表1所示)，编号分别为2a07、1b03和1a12，

10、表1

11、 抗体 vhh链序列 cdr1 cdr2 cdr3 2a07 seq id no:1 seq id no:2 seq id no:3 seq id no:4 1b03 seq id no:5 seq id no:6 seq id no:7 seq id no:8 1a12 seq id no:9 seq id no:10 seq id no:11 seq id no:12

12、第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的识别cd276-car分子的纳米抗体。

13、优选地，编码纳米抗体2a07的核苷酸序列如seq id no:13所示。

14、优选地，编码纳米抗体1b03的核苷酸序列如seq id no:14所示。

15、优选地，编码纳米抗体1a12的核苷酸序列如seq id no:15所示。

16、第三方面，本发明提供第一方面所述的识别cd276-car分子的纳米抗体在检测cd276-car-t细胞中的应用。

17、第四方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的识别cd276-car分子的纳米抗体。

18、优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。

19、第五方面，本发明提供一种检测样品中cd276-car分子的试剂盒，所述试剂盒中包括第一方面所述的识别cd276-car分子的纳米抗体。

20、第六方面，本发明提供第五方面所述的检测样品中cd276-car分子的试剂盒在测定抗药抗体水平中的应用。

21、以下为纳米抗体对应的氨基酸序列，以下氨基酸序列中下划线的序列表示cdr区。

22、(1)纳米抗体2a07

23、氨基酸序列：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4，如seq id no:1所示，其中划线部分为cdr区：

24、qarfvesggglvqpggslrlscaasgftldnyaigwfrqapgkeregvlcisiedgaty yadsvkgrftisrdnaknmvylqihglkpedtavyycatvddgsswcpsyisglgdydyw gqgtqvtvst。

25、seq id no:2(cdr1)

26、gftldnya。

27、seq id no:3(cdr2)

28、isiedgat。

29、seq id no:4(cdr3)

30、atvddgsswcpsyisglgdydy。

31、(2)纳米抗体1b03

32、氨基酸序列：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4，如seq id no:5所示，其中划线部分为cdr区：

33、maavqlvdsggglvqpggslrlscaasgftldyyaigwfrqapgkeregvscistsdgstyyadsvkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycatardieftnvqamgvmndadfgswgqgtqvtvss。

34、seq id no:6(cdr1)

35、gftldyya。

36、seq id no:7(cdr2)

37、istsdgst。

38、seq id no:8(cdr3)

39、atardieftnvqamgvmndadfgs。

40、(3)纳米抗体1a12

41、氨基酸序列：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4，如seq id no:9所示，其中划线部分为cdr区：

42、alqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsnyamgwarqvpgkglewvsaiysdglt yyadpvkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyncaretdeatlweydswgqgtlvt vss。

43、seq id no:10(cdr1)：

44、gftfsnya。

45、seq id no:11(cdr2)：

46、iysdglt。

47、seq id no:12(cdr3)：

48、aretdeatlweyds。

49、本发明中涉及的核苷酸序列如下所示：

50、(1)编码纳米抗体2a07的核苷酸序列如seq id no:13所示；

51、seq id no:13：

52、caggcgcgtttcgtggagtctgggggaggcttggtgcagcctggggggtctctgagactctcctgtgcagcctccggattcactttggataattatgccataggctggttccgccaggccccagggaaggagcgcgagggggtcttatgtattagtattgaagatggtgccacatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaatgccaagaacatggtgtatctgcaaattcacggcctgaaacctgaggacacggccgtttattactgtgcgacagttgatgacggtagtagctggtgcccatcctacatctcggggctaggggactatgactactggggccaggggacccaggtcaccgtctccaca。

53、(2)编码纳米抗体1b03的核苷酸序列如seq id no:14所示；

54、seq id no:14：

55、gccgtgcagctggtggattctgggggaggcttggtgcagcctggggggtctctgagactctcctgtgcagcctctggattcactttggattattatgccataggctggttccgccaggccccaggaaaggagcgcgagggggtctcatgtattagtactagtgatggtagcacatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaatgccaagaacacggtttatctacaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccgtttattactgtgcgacagcgagggatatagagtttactaatgttcaggctatgggtgttatgaacgacgctgactttggttcctggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcg。

56、(3)编码纳米抗体1a12的核苷酸序列如seq id no:15所示；

57、seq id no:15：

58、gcgctgcaactggtggagtctgggggaggcttggtgcagcctggggggtctctgagactctcctgtgccgcctctggattcaccttcagtaactatgccatgggctgggcccgccaggttccagggaaggggctcgagtgggtgtccgctatttatagtgatggtctcacatactatgcagacccagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccgtctataactgtgcgcgtgaaacggatgaagcgactttgtgggagtatgactcctggggccaggggaccctggtcaccgtctcctca。

59、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

60、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

61、本发明所述识别cd276-car分子的纳米抗体能够特异性识别cd276-car-t细胞上cd276-car分子；所述识别cd276-car分子的纳米抗体与cd276-car分子的亲和力高，所述识别cd276-car分子的纳米抗体可以用于检测cd276-car-t细胞的转染效率。