一种用于检测副鸡禽杆菌的引物探针组与试剂盒及应用的制作方法

本申请涉及检测副鸡禽杆菌检测，本申请尤其涉及一种用于检测副鸡禽杆菌的引物探针组与试剂盒及应用。

背景技术：

1、副鸡禽杆菌(apg)是引起鸡传染性鼻炎的主要病原，一旦发病会出现鸡面部、肉髯肿胀、流鼻涕等症状，严重时可造成生产性能下降，甚至鸡只死亡。此外，传染性鼻炎的发生会降低鸡对其他病原的抵抗力，造成多种呼吸道传染性疾病同时发生，进一步影响生产性能。因此，对副鸡禽杆菌的诊断要及时、准确，这对养鸡企业来说意义重大。

2、目前，已有较多的副鸡禽杆菌的检测方法，如细菌分离、生化鉴定、elisa等血清学检测方法以及普通pcr等核酸检测方法。但是以上方法各有优缺点。

3、细菌分离以及elisa等血清学检测方法检测周期长，同时elisa需要高度特异性和敏感性的抗体，并且操作步骤繁琐，操作过程易出现待测样本的污染，从而导致检测精确度不高。

4、而普通pcr虽然是目前常用的核酸检测技术，但该技术需要将获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据特定条带的大小来初步确定结果，并且存在耗时、繁琐、容易产生污染的问题。

技术实现思路

1、为了解决上述至少一种技术问题，本申请提供一种快速、灵敏检测副鸡禽杆菌的引物探针组与试剂盒及应用。

2、第一方面，本申请提供一种用于检测副鸡禽杆菌的引物探针组，所述引物探针组包括上游引物apg-f、下游引物apg-r以及荧光探针apg-p；

3、其中，所述上游引物apg-f基因序列如seq id no.1所示；

4、所述下游引物apg-r基因序列如seq id no.2所示；

5、所述荧光探针apg-p基因序列如seq id no.3所示；

6、所述荧光探针apg-p基因序列中，5'端方向末端连接的胞嘧啶脱氧核苷酸携带荧光报告基团；3'端方向一侧末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带荧光淬灭基团。

7、通过采用上述技术方案，本申请提高了检测精确度。其机理在于：本申请首先针对引起鸡传染性鼻炎的主要病原副鸡禽杆菌，设计了特异性强的引物探针组，所述引物探针组包括上游引物apg-f、下游引物apg-r以及荧光探针apg-p。以上这些引物探针组特异性强，并且和待测样本进行反应时能够快速且精准地捕获目标基因片段，从而提高检测精确度以及缩短检测所需时间。

8、可选的，所述荧光探针apg-p基因序列中，5'端方向末端连接的胞嘧啶脱氧核苷酸携带的荧光报告基团为fam，3'端方向末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带的荧光淬灭基团为bhq1。

9、第二方面，本申请提供一种用于检测副鸡禽杆菌的引物探针组在生物检测领域以及制备检测产品领域的应用。

10、第三方面，本申请提供一种用于检测副鸡禽杆菌的检测试剂盒，所述试剂盒包括本申请提供的seq id no.1、seq id no.2以及seq id no.3。

11、可选的，所述试剂盒还包括pcr组合物；所述pcr组合物包括无核酸酶水、pcr mix。

12、通过采用上述技术方案，本申请降低了检测成本，同时实现了操作简便的效果。其机理在于：本申请通过提供一种用于检测副鸡禽杆菌的检测试剂盒，解决了传统检测技术中存在的操作复杂、耗时长、易污染、临床应用推广难等问题。

13、可选的，所述试剂盒中部分组分浓度如下：

14、所述seq id no.1终浓度为0.15～0.4μmol/l、seq id no.2终浓度为0.15～0.4μmol/l、seq id no.3终浓度为0.15～0.4μmol/l。

15、优选的，所述seq id no.1终浓度为0.25μmol/l、seq id no.2终浓度为0.25μmol/l、seq id no.3终浓度为0.25μmol/l。

16、可选的，所述试剂盒还包括阳性对照品；

17、所述阳性对照品为副鸡禽杆菌的阳性质粒。

18、第四方面，本申请提供一种用于检测副鸡禽杆菌的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

19、s1、提取样本dna；

20、s2、对由步骤s1获得的样本dna进行荧光pcr扩增反应；

21、s3、荧光pcr扩增反应结束后，根据pcr扩增的结果进行判读；

22、所述荧光pcr扩增反应包括本申请所述的一种用于检测副鸡禽杆菌的引物探针组。

23、通过采用上述技术方案，本申请实现了操作简便、检测精确度高、特异性强的效果。其机理在于，本申请提供的一种用于检测副鸡禽杆菌的检测方法在对待测样本进行检测时，具有整个实验操作简便、成本低以及检测精确度高的优势；同时，本申请所选择的引物探针组特异性强，结果易于判读，对仪器的要求不高，并且整个pcr过程采用全封闭形式，避免了交叉污染的可能，使检测结果更加精准。

24、优选的，所述荧光pcr扩增反应所需的反应条件为如下：95℃30s；95℃5s，60℃30s，收集荧光，40个循环。

25、可选的，所述结果判读依据为如下：

26、当样本有明显扩增曲线，同时ct值小于35判为阳性；

27、当样本无扩增曲线，同时ct值大于等于35判为阴性。

28、综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：

29、1.本申请提供的检测副鸡禽杆菌的引物探针组，具有特异性强的特点；

30、2.本申请提供的一种检测副鸡禽杆菌的检测试剂盒能够克服现有技术中存在的成本高、操作复杂、检测周期长等问题，具有成本低、操作简便、检测时间短等优势；

31、3.本申请提供的一种用于检测副鸡禽杆菌的检测方法，能够克服传统检测方法中存在的精确度不高、操作复杂、耗时长等问题，具有检测精确度高、操作简便、成本低的优势。

技术特征：

1.一种用于检测副鸡禽杆菌的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括上游引物apg-f、下游引物apg-r以及荧光探针apg-p；

2.根据权利要求1所述的一种用于检测副鸡禽杆菌的引物探针组，其特征在于，所述荧光探针apg-p基因序列中，5' 端方向末端连接的胞嘧啶脱氧核苷酸携带的荧光报告基团为fam，3' 端方向末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带的荧光淬灭基团为bhq1。

3.一种权利要求1所述的一种用于检测副鸡禽杆菌的引物探针组在生物检测领域以及制备检测产品领域的应用。

4.一种用于检测副鸡禽杆菌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的seq id no.1、seq id no.2以及seq id no.3。

5.根据权利要求4所述的一种用于检测副鸡禽杆菌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pcr组合物；所述pcr组合物包括无核酸酶水、pcr mix。

6.根据权利要求4所述的一种用于检测副鸡禽杆菌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中部分组分浓度如下：

7.据权利要求4所述的一种用于检测副鸡禽杆菌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品；

8.一种用于检测副鸡禽杆菌的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：

9.根据权利要求8所述的一种用于检测副鸡禽杆菌的检测方法，其特征在于，所述结果判读依据为如下：

技术总结
本申请公开了一种用于检测副鸡禽杆菌的引物探针组与试剂盒及应用,所述一种用于检测副鸡禽杆菌的引物探针组，包括上游引物APG‑F、下游引物APG‑R以及荧光探针APG‑P；其中，所述上游引物APG‑F基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游引物APG‑R基因序列如SEQ ID NO.2所示；所述荧光探针APG‑P基因序列如SEQ ID NO.3所示；同时，本申请提供一种检测副鸡禽杆菌的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括检测副鸡禽杆菌的引物探针组。本申请优点是，本申请试剂盒能够实现对副鸡禽杆菌的快速检测，且操作简单，灵敏准确。

技术研发人员：孙松松
受保护的技术使用者：北京家禽育种有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14