本发明涉及细胞培养，具体为一种口腔黏膜细胞的培养方法。
背景技术：
1、口腔里的细胞都是有着同样的形态，功能，统称为口腔细胞。口腔细胞有牙髓细胞、牙周膜细胞、唾液腺细胞、口腔黏膜细胞、破骨细胞、成骨细胞、软骨细胞、口腔肿瘤细胞等等。但一般所谓的口腔细胞指的是口腔表皮细胞。各个细胞产生时很相似，经过分化，形态、结构产生差异。
2、口腔黏膜上皮细胞主要指的是排列密集的上皮细胞结构。口腔黏膜细胞大多数是扁平多边形的，分布在口腔两侧颊黏膜处，口腔黏膜上皮细胞属于口腔黏膜一部分，表面看起来明显角化或者是不全角化。口腔黏膜上皮细胞有一定的作用，主要是起到了耐摩擦的效果，可以避免异物入侵，如果上皮细胞缺少容易出现口腔疾病。在上皮的垂直切面上，口腔黏膜细胞形状不一，紧靠基膜的一层基底细胞为矮柱状，为具有增殖分化能力的干细胞，部分子细胞向浅层移动，基底层以上是数层多边形细胞，再上为几层梭形或扁平细胞，仅靠近表面几层细胞为扁平状，基底层细胞能不断分裂增生，以补充表层衰老或损伤脱落的细胞，复层扁平上皮深层的结缔组织内有丰富的毛细血管，有利于复层扁平上皮的营养。
3、细胞培养是指在体外模拟体内环境(无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等)，使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。细胞培养技术是细胞生物学研究方法中重要和常用技术，通过细胞培养既可以获得大量细胞，又可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢、细胞的生长增殖等。细胞培养需要的环境因素有：无菌环境、合适的温度、适宜的渗透压、理想的气体环境和ph。细胞培养的一般过程包括：准备工作、取材、培养、冷冻及复苏。
4、口腔粘膜上皮细胞的体外培养具有重要的生物学及临床意义。它不仅为研究口腔粘膜分化、口腔病理生理、毒理学及癌发生机理等提供良好的实验体系，也对人类组织工程化口腔粘膜构建和口腔粘膜组织缺损修复具有重要意义，同时对于眼睑、喉、气管及尿道等粘膜缺损的修复重建有重要临床意义。构建组织工程化尿道需要足够数量的种子细胞，人们尝试利用口腔黏膜细胞作为种子细胞，而种子细胞的增殖能力和纯度与细胞分离的效果密切相关。
5、现有技术中的口腔黏膜培养方法，细胞容易出现老化，细胞贴壁及增殖能力均明显减弱，无法达到组织工程的需要。
技术实现思路
1、鉴于现有技术中所存在的问题，本发明公开了一种口腔黏膜细胞的培养方法，采用的技术方案是，包括以下步骤：
2、s1：口腔黏膜细胞标本的获取和处理：无菌条件下收集年龄10～50岁健康人口腔修复手术中切除的口腔黏膜，将所收集到的黏膜置于培养基中，用d-hanks或hanks液清洗，以去除表面血迹，并用镊子去除黏附的结缔组织等非培养所需组织，再用缓冲液浸泡5～8分钟，尽量去除黏膜下组织，再用手术刀将黏膜组织切成0.3cm～1cm大小的若干组织块，静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次；
3、s2：口腔黏膜细胞标本的分组：每个标本分成相等两份，其中一份放入2.5g/l的消化酶溶液，放置于4℃冰箱消化16～18小时；另一份则置2.5g/l的胰酶，放置于4℃冰箱16～18小时，两组分离时间相同；
4、s3：消化分离：用镊子将表皮撕下，将两组的上皮分别用2.5g/l的胰酶37℃震荡消化5～10分钟，加入混合消化液终止消化，用吸管吹打成单细胞液，用d-hanks液洗涤两次，加入培养液，以差速贴壁法排除成纤维细胞；
5、s4：原代培养：台盼蓝染色，血细胞计数板计数活细胞，细胞悬液接种密度为2.5x104个/cm，接种于预涂胶原的24孔培养板中，置于细胞培养箱中静置培养，当原代培养细胞可以黏附于瓶壁，并伸展开始生长时，可补加原培养液量1/2的新培养液，第5天首次换液，以后每2～3天换液1次，一般7～14天可以长满瓶壁，进行传代；
6、s5：传代培养：传代培养细胞生长、增殖至80％～90％融合时传代，吸去或倒掉培养瓶内旧培养液，再向瓶内加人混合消化液，以能覆盖培养瓶底为宜，37℃消化，再将培养瓶放在相差显微镜下进行观察，当发现胞质回缩，细胞间隙增大后立即终止消化，吸出消化液，向瓶内加入d-hanks液轻轻转动培养瓶，重复2～3次把残留的消化液冲掉，然后再加入培养液，使用弯头吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复吹打瓶壁细胞，使瓶壁细胞从瓶壁脱离形成单细胞悬液，用计数板计数后，以1:3或1:4分别接种于新的培养瓶中，置于co2培养箱中进行培养，2～3天后换一次生长液，待细胞铺满器皿底面，即可使用，也可继续传代扩大培养或换成维持液。
7、作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤s1中的缓冲液为2.5g/l洗必泰液。
8、作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤s1中的培养基是分数为10％血清的dmem。
9、作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤s2中的消化酶为dispaseii溶液，所述胰酶为胰酶-edta。
10、作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤s3中的混合消化液为0.125％胰蛋白酶：0.02％edta＝1:1，所述培养液为dmem:f12＝3:1，加10％胎牛血清。
11、作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤s4中细胞培养箱内部温湿度条件为：37℃、5％co2饱和湿度。
12、作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤s4中的静置培养时长一般3～5天。
13、作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤s5中消化时长为3～5分钟。
14、本发明的有益效果：本发明通过获取和处理口腔黏膜细胞组织标本、利用胰酶对标本进行分组消化分离、对黏膜细胞进行体外原代培养和传代培养，提高了口腔黏膜细胞的分离纯度，细胞不容易出现老化，使口腔黏膜细胞在一定时间内保持增殖能力，提高了口腔黏膜细胞的贴壁及增殖能力，同时应用dispaseii分离的无血清培养技术，短期内能够获得更多数量且活力高的口腔黏膜细胞，可初步满足组织工程化黏膜培养需求。
1.一种口腔黏膜细胞的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤s1中的缓冲液为2.5g/l洗必泰液。
3.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤s1中的培养基是分数为10％血清的dmem。
4.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤s2中的消化酶为dispaseii溶液，所述胰酶为胰酶-edta。
5.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤s3中的混合消化液为0.125％胰蛋白酶：0.02％edta＝1:1，所述培养液为dmem:f12＝3:1，加10％胎牛血清。
6.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤s4中细胞培养箱内部温湿度条件为：37℃、5％co2饱和湿度。
7.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤s4中的静置培养时长一般3～5天。
8.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤s5中消化时长为3～5分钟。