一种肺腺癌标志物及其在制备肺腺癌筛查试剂盒或治疗监测试剂盒中的应用

本发明属于肺腺癌筛查诊断领域，具体涉及一种肺腺癌筛查标志物及其诊断和治疗监测试剂盒。

背景技术：

1、肺癌主要分为小细胞肺癌(14％的病例)和非小细胞肺癌(nsclc)(82％的病例)来治疗。nsclc是一个高度异质性的人群，主要分为肺腺癌和肺鳞状细胞癌。近年来随着靶向和免疫治疗药物的广泛使用，如血管生成抑制剂、表皮生长因子受体抑制剂和程序性死亡配体1及程序性细胞死亡蛋白1抑制剂，nsclc的治疗现状已经大为改善。然而，nsclc的病死率依然高居所有癌症的榜首，主要原因是肺癌的早期症状不明显，大多数患者在出现症状时已有转移的迹象，加之现有治疗方法只对部分患者有效，这都是导致高死亡率的主要原因。超过一半(55％)的i期或ii期nsclc患者接受手术治疗；相比之下，只有21％的iii期nsclc患者接受手术治疗，而大多数(61％)患者接受化疗和/或放射治疗。因此，早期诊断和治疗是降低nsclc死亡率的一个有效措施。

2、目前，低剂量螺旋ct(ldct)是筛查早期肺癌的主要方法，可以显著提高肺癌患者的生存率。然而，假阳性率高和辐射暴露是其缺点。病理诊断是nsclc诊断的金标准，但采集组织活检的操作有一定的局限性和风险，而且在很多情况下，组织不容易获得。传统生物标志物的作用很大程度上受到肿瘤异质性的空间和时间限制，血液肿瘤标志物如癌胚抗原(cea)、神经元特异性烯醇化酶(nse)和细胞角蛋白19的可溶性片段(cyfra21-1)等的敏感性和/或特异性并不令人满意。

3、环状rna(circular rna,circrna)是单链的、共价封闭的rna分子，由pre-mrna通过一个被称为反向剪接的过程产生。与传统的线性rna不同，circrna具有高度稳定性，可以在外泌体、无细胞唾液和血浆中发现。circrna可能参与上皮-间质转化、微小rna(microrna，mirna)抑制和肿瘤发生。此外，circrna的表达可以是组织特异性的，也有研究证明一些非编码的circrna能够翻译成蛋白。随着高通量测序技术和新的生物信息学算法的发展，circrna可以被系统地检测出来，因此，它们可以成为潜在的诊断生物标志物或治疗目标。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种肺腺癌标志物，包括circ_0006949。

2、优选的是，circ_0006949的核苷酸序列如seq id no：1所示。

3、上述任一项优选的是，所述circ_0006949为环状rna。

4、上述任一项优选的是，所述标志物为痰标志物。

5、和传统的血清标志物不同，痰标本离肺组织更近，能够更加准确的反应肿瘤导致的变化，而且比采集血液创伤小，通常为非侵入性采集的方法。因此，为了找到肺腺癌患者痰标本中特异性上调的circrna，本发明收集了10名健康人、10名肺部感染患者和30名肺腺癌患者的痰液标本，分为三组，将每组的10份标本平均混合，进行差异性circrna筛选。将cirrna芯片筛选出来的上调cirrna进行差异分析发现，有176个circrna在肺腺癌患者痰标本中特异性上调(见图1-2)。经过分析本发明挑选了一个可能与谷氨酰胺合成代谢有关的hsa_circ_rna 0006949(circ_0006949)进行深入验证。通过rnase r实验证明了circ_0006949不容易被rna酶降解，的确是一个环状rna。研究进一步收集了大量正常人和肺腺癌患者痰标本进行验证发现，早期肺腺癌患者痰标本中circ_0006949显著高于正常人，表明其确实有成为诊断标志物的潜力(见图3)。接下来将circ_0006949与常见肺癌血清标志物cea,nse，cyfra21-1,糖类抗原199(carbohydrate antigen199，ca199)和胃泌素释放肽前体(pro-gastrin-releasing peptide，progrp)等进行诊断效能分析发现，circ_0006949的曲线下面积显著高于其它血清标志物，将其与血清标志物联合应用能够提升肺腺癌的诊断效能(见图4)。而且手术治疗后患者的痰标本中circ_0006949显著下调(见图5)，因此本发明发现的circ_rna确实具有治疗疗效监测效果。

6、上述任一项优选的是，通过pcr的方式在痰液中检测circ_0006949表达，pcr引物序列如seq id no：2和seq id no：3所示。

7、本发明通过circ_0006949作为肺腺癌诊断或治疗疗效监测的痰标志物进行检测的步骤包括以下步骤：

8、步骤1：提取痰液中的总rna。总rna的提取步骤为本领域常规的总rna提取的方法，现有文献公开的总rna提取技术或市售rna提取试剂盒均可应用于本发明，其具体方法在此不进行详述。

9、步骤2：将总rna逆转录成互补脱氧核糖核酸cdna。逆转录步骤为本领域常规的总rna提取的方法，现有文献公开的逆转录方法或市售逆转录试剂盒均可应用于本发明，其具体方法在此不进行详述。

10、步骤3：pcr定量检测。

11、优选的，步骤3中，pcr反应中hsa_circ_0006949上下游异向引物(divergentprimers)分别是seq id no：2所示的核苷酸序列:5’-accatagtgcacacctcagtt-3’和seq idno：3所示的核苷酸序列:5’-ggggtatccatagctgtgct-3’。

12、优选的，步骤3中，pcr反应中内参基因gapdh上下游引物分别是seq id no：4所示的核苷酸序列：5’-gagtcaacggatttggtcgt-3’和seq id no：5所示的核苷酸序列：5’-ttgattttggagggatctcg-3’。

13、优选的，步骤3中，所述pcr反应为荧光定量pcr；进一步优选的是，肺腺癌诊断的cutoff值为1.36(2-δδct>1.36为阳性；2-δδct<1.36为阴性)，痰液中circ_0006949 2-δδct值>1.36作为肺腺癌的早期筛查诊断的标准；进一步优选的是，2-δδct值<0.9作为肺腺癌患者术后的治疗监测的标准。

14、上述任一项优选的是，所述标志物circ_0006949为肺腺癌组织和/或细胞标志物。

15、circ_0006949和其调控的代谢酶基因glul(gene id:2752)在肺腺癌患者肺腺癌组织、细胞中的表达高于正常人水平。circ_0006949在肺腺癌组织和细胞中都主要定位于胞浆中。

16、circ_0006949作为肺腺癌组织和/或细胞标志物，检测circ_0006949在肺腺癌组织和/或细胞中的表达量，包括以下步骤：

17、步骤1：样本收集，收集肺腺癌细胞、组织或癌旁组织。

18、步骤2：提取总rna。总rna的提取步骤为本领域常规的总rna提取的方法，现有文献公开的总rna提取技术或市售rna提取试剂盒均可应用于本发明，其具体方法在此不进行详述。

19、步骤3：线性rna消除。优选的使用rnase r处理rna。所使用的rnase r为市售产品，具体方法参照产品说明书。

20、步骤4：产物进行逆转录，并通过定量pcr检测。

21、优选的，步骤4中glul上下游引物分别是seq id no：6所示的核苷酸序列：5’-ctccactgtacggcgtagtc-3’和seq id no：7所示的核苷酸序列：5’-tgctttccccaacacaccaa-3’。

22、优选的，步骤4中hsa_circ_0006949上下游异向引物(divergent primers)分别是seq id no：2所示的核苷酸序列:5’-accatagtgcacacctcagtt-3’和seq id no：3所示的核苷酸序列:5’-ggggtatccatagctgtgct-3’。

23、优选的，步骤4中pcr反应中内参基因gapdh上下游引物分别是seq id no：4所示的核苷酸序列：5’-gagtcaacggatttggtcgt-3’和seq id no：5所示的核苷酸序列：5’-ttgattttggagggatctcg-3’。

24、上述任一项优选的是，应用circ_0006949的原位杂交或pcr反应检测肺腺癌组织、细胞或癌旁组织中的一种进行检测。

25、上述任一项优选的是，原位杂交优选的circ_0006949探针及内参探针购买自广州锐博公司，产品编号为：lnc1032286ribotm h-hsa_circ_0006949_fish-probe mix，lnc110101ribotm h-u6 fish probe mix，lnc110102ribotm h-18s fish probe mix。公众可通过商业购买的方式获得。

26、上述任一项优选的是，应用pcr反应检测肺腺癌组织、细胞或癌旁组织中的一种进行检测，所述pcr反应的circ_0006949引物包括seq id no：2和/或seq id no：3所示的核苷酸序列。上述任一项优选的是，应用pcr反应检测肺腺癌组织、细胞或癌旁组织中的一种进行检测，所述pcr反应的内参引物包括seq id no：4和/或seq id no：5所示的核苷酸序列。

27、上述任一项优选的是，所述标志物circ_0006949与血清标志物cyfra21-1,cea,ca19-9,nse、progrp或scc中的至少一种联合使用。将circ_0006949与常见肺癌血清标志物cyfra21-1,cea,ca19-9,nse，progrp，scc等进行诊断效能分析发现，circ_0006949的曲线下面积显著高于其它血清标志物，将其与血清标志物联合应用能够提升肺腺癌的诊断效能。

28、本发明通过circ_0006949识别序列对circ_0006949进行定位或识别，实现了肺腺癌的诊断和治疗监测。circ_0006949识别序列包括与circ_0006949序列特异性结合的核苷酸探针、引物序列等，优选的circ_0006949序列为seq id no：1所示的核苷酸序列。识别的靶点为痰液或肺腺癌组织、细胞或癌旁组织。由于痰标本的留取具有无创性，而且检测价格低廉，因此更具优势。

29、本发明还提供了上述任一项所述的标志物circ_0006949在制备肺腺癌筛查试剂盒或治疗监测试剂盒中的应用。

30、本发明还提供了一种用于肺腺癌筛查试剂盒或治疗监测的试剂盒，所述试剂盒检测上述任一项所述的标志物。

31、优选的是，所述试剂盒包括circ_0006949识别序列，所述试剂盒通过所述circ_0006949识别序列识别目标样品中的核苷酸序列。

32、上述任一项优选的是，所述circ_0006949识别序列包括如seq id no：2、seq idno：3的核苷酸序列。

33、上述任一项优选的是，通过商业购买的方式获得所需探针，优选的购买自广州锐博公司，产品编号为：lnc1032286ribotm h-hsa_circ_0006949_fish-probe mix，lnc110101ribotm h-u6 fish probe mix，lnc110102ribotm h-18s fish probe mix。

34、上述任一项优选的是，在所述circ_0006949识别序列上进行荧光、生物素、地高辛等发光基团的修饰。

35、上述任一项优选的是，所述circ_0006949识别序列为circ_0006949引物序列和/或circ_0006949探针序列。

36、上述任一项优选的是，所述circ_0006949识别序列识别目标样品中的核苷酸序列，识别方法包括：pcr反应、原位杂交等。肺癌的高发病率和高死亡率使得肺癌的基础和转化研究成为热点。nsclc的病死率依然居高不下，主要原因是肺癌的早期症状不是很明显导致早诊早治的机会降低。通过高通量筛选加大量样本验证的方法我们发现肺腺癌患者痰标本中circ_0006949显著高于正常人，是肺腺癌早期诊断的生物标志物，这一发现具有原创性；痰标本的留取具有无创性，这是本研究的一个特色和优势；而且检测价格低廉，适合推广应用。