一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的方法及其用途与流程

本发明属于生物医学领域，涉及一种将间充质干细胞诱导分化为胰岛细胞的诱导方法。

背景技术：

1、糖尿病是严重危害人类健康的常见多发病，目前治疗以注射胰岛素和药物为主，不仅给患者带来很大痛苦，对社会和家庭也造成沉重负担。近几年采用胰岛细胞或胰腺移植治疗糖尿病取得了一些疗效，但遗憾的是仍然面临两大难题：供体匮乏和免疫排斥。干细胞是一群较原始的细胞，具有自我更新的能力。间充质干细胞因来源广泛、易于培养和自体移植的特点，从而更加受到学者的青睐。

2、干细胞的优势是可自体来源,避免了免疫抑制剂的使用,将为糖尿病的细胞替代治疗提供了新的思路。干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞,分为胚胎干细胞(embryon ic stem cel,iesc)和成体干细胞(adu lt stem ce l1,asc)。而成体干细胞来源广泛，无伦理争议，可作为胰岛细胞的来源。

3、目前的干细胞诱导方式主要有体外诱导、基因修饰、蛋白转导与组织微环境诱导，其中体外诱导是采用不同刺激因子组合，将干细胞诱导分化为目的细胞。各实验室诱导分化条件各异，诱导分化机制尚不明确，诱导分化效率低，胰岛分泌能力仅为正常胰岛1％左右，且诱导过程复杂，诱导时间长，所得细胞数量少，功能低。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决现有技术中存在的上述问题，提供一种将间充质干细胞诱导分化成胰岛细胞的诱导方法及其应用，各成分均安全无毒性，诱导分化所需步骤少、时间短，诱导效率高。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案包括以下步骤：

3、1)间充质干细胞的分离，间充质干细胞可以来源于包括但不限于骨髓、脾源性胰腺干细胞、巢蛋白(nestin)阳性干细胞、神经源性胰腺干细胞、肝源性胰腺干细胞、肠源性胰腺干细胞等，通过常规方法均可以分离得到间充质干细胞。

4、2)配置诱导培养基：以高糖dmem为基础培养基，添加尼克酰胺15-20mmol/l、细胞生长因子150-500pmol/l、glp-1 5-15mg/l、β--巯基乙醇0.05-0.3mmol/l，最后加入10-20％(v/v)的人血白蛋白以及0.5-1％亚硒酸(v/v)，混匀，4℃保存备用。

5、所述的细胞生长因子可以为碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、角化细胞生长因子中的一种或多种。

6、3)体外诱导分化：将所述的间充质干细胞加入诱导培养基至于4-6％co2、94-96％饱和湿度的36-38°培养箱中培养，每3-5x105个的细胞中加入3ml诱导培养基，悬浮培养。

7、4)每24h半量换液，培养4-6天，得胰岛分泌细胞。

8、本发明的一种将间充质干细胞诱导分化为胰岛细胞的方法，具有以下优势：

9、1、无需基因转染，故无基因改变和癌症风险；

10、2、显著缩短周期：本发明的诱导培养基仅需要5天即可到达诱导峰值。

11、3、显著提高诱导细胞胰岛素分泌功能。

12、4、间充质干细胞诱导分化为胰岛细胞后，移植后无排斥，无伦理问题，安全性高，具有广阔的临床应用前景。

技术特征：

1.一种将间充质干细胞诱导分化为胰岛细胞的诱导剂，其特征为，由以下组分组成：尼克酰胺、碱性成纤维细胞生长因子、glp-1、β--巯基乙醇、人血白蛋白和亚硒酸。

2.根据权利要求1所述的一种将间充质干细胞诱导分化为胰岛细胞的诱导剂，其特征在于，各组分的含量为尼克酰胺15-20mmol/l、细胞生长因子150-500pmol/l、glp-1 5-15mg/l、β--巯基乙醇0.05-0.3mmol/l，10-20％(v/v)的人血白蛋白以及0.5-1％亚硒酸(v/v)。

3.根据权利要求2所述的一种将间充质干细胞诱导分化为胰岛细胞的诱导剂，其特征在于，各组分的含量为尼克酰胺20mmol/l、细胞生长因子150pmol/l、glp-1 5mg/l、β--巯基乙醇0.05mmol/l，10％(v/v)的人血白蛋白以及0.5％亚硒酸(v/v)。

4.根据权利要求2所述的一种将间充质干细胞诱导分化为胰岛细胞的诱导剂，其特征在于，各组分的含量为尼克酰胺15mmol/l、细胞生长因子500pmol/l、glp-1 15mg/l、β--巯基乙醇0.3mmol/l，20％(v/v)的人血白蛋白以及1％亚硒酸(v/v)。

5.一种间充质干细胞诱导分化为胰岛细胞的培养基，其特征在于，包含高糖dmem基础培养基以及权利要求1-4所述的诱导剂。

6.一种诱导间充质干细胞诱导分化为胰岛细胞的方法，其特征在于使用权利要求1-4所述的诱导剂或权利要求5所述的培养基进行诱导培养。

7.根据权利要求6所述的方法，其具体步骤为：

8.根据权利要求6所述的方法，间充质干细胞可以来源于骨髓、脾源性胰腺干细胞、巢蛋白(nestin)阳性干细胞、神经源性胰腺干细胞、肝源性胰腺干细胞、肠源性胰腺干细胞，优选为骨髓间充质干细胞。

9.权利要求1-4所述的诱导剂以及权利要求5所述的培养基在诱导间充质干细胞向为胰岛细胞分化中的应用。

10.由权利要求6或7的方法得到的胰岛样细胞在制备治疗糖尿病试剂盒中的应用。

技术总结
本发明属于生物医学领域，涉及一种将间充质干细胞诱导分化为胰岛细胞的方法以及其应用。其包含诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的诱导剂，由以下组分组成：尼克酰胺、碱性成纤维细胞生长因子、GLP‑1、β‑‑巯基乙醇、人血白蛋白和亚硒酸以及基础培养基。本发明的一种将间充质干细胞诱导分化成胰岛细胞的方法，诱导步骤简单，诱导周期短，获得的胰岛样细胞胰岛素分泌功能显著提高，并能显著降低糖尿病模小鼠血糖的浓度。

技术研发人员：李文东,杜文敬
受保护的技术使用者：广东华夏健康生命科学有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14