一种抗IFN-γ自身抗体的纯化工艺及其应用

本发明涉及生物，特别是涉及一种抗ifn-γ自身抗体的纯化工艺及其应用。

背景技术：

1、抗体长期以来一直用于研究，但针对人体产生的自身抗体由于缺乏适当的分离纯化方法，因此，一直难以更深层次地研究以抗原抗体相互作用为基础的原发型自身免疫缺陷病。

2、抗ifn-γ自身抗体免疫缺陷综合征是一种新近发现的原发性免疫缺陷表型，抗干扰素自身抗体(即抗ifn-γ自身抗体)是其致病的主要原因。作为一种尚未被准确定义的自身抗体，由于其产生机制涉及交叉免疫现象，不同种属免疫原性的差异，导致其在模式生物中表达受限，无法实现快速、准确、高纯度、高活性的研究需求。而常用的以硫酸铵沉淀为主体架构的抗体纯化手段费时费力，并且对抗体活性存在影响。同时，由于上述抗干扰素自身抗体缺乏特异性结合位点，常规使用的沉淀法、层析法得到的抗体纯度低、特异性差，且整套分离纯化方法步骤繁琐。上述原因导致目前基于抗ifn-γ自身抗体的研究，都是基于患者的血清或者血浆，并非纯化后的抗ifn-γ自身抗体。因此，需要一种针对抗ifn-γ自身抗体的纯化工艺方法，能够在不引入硫酸铵的前提下，从复杂的血液成分中将抗ifn-γ自身抗体分离出来，且得到的抗ifn-γ自身抗体产率高，纯度高，能够保持抗ifn-γ自身抗体的天然构型。

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明提供一种抗ifn-γ自身抗体的纯化工艺，该纯化工艺将生物样本经过深层过滤后，通过亲和层析法将复杂的血液成分进行分离，然后再通过超滤法进行浓缩，利用亲和层析的抗原抗体反应，使得到的抗ifn-γ自身抗体能够保证抗体的天然构型。并且整个纯化工艺无需硫酸铵为代表的盐析技术参与，纯化得到的抗ifn-γ自身抗体产率高、纯度高。

2、本发明提供了一种抗ifn-γ自身抗体的纯化工艺，包括以下步骤：将生物样本进行深层过滤，得到上清液，将所述上清液进行亲和层析，得到初提物，采用超滤法进行浓缩，得到抗ifn-γ自身抗体。

3、本发明人在研究过程中发现，若采用常规的硫酸铵盐析法对抗体进行纯化，科研级别抗体在硫酸铵沉淀过程中带入大量硫酸盐等杂质，引起产品水解后呈现酸性损伤蛋白质活性，在沉淀过程中存在高ph释氨的发生，对后续所有实验仪器以及实验操作者产生危害。其次，硫酸铵的残留对后续精细实验如质谱，分子相互作用的监测存在巨大影响，后续如进行脱盐步骤将会大量损失抗体成分。而现有技术中又因为缺乏对抗ifn-γ自身抗体的特异性结合位点，因此，采用常规的沉淀法、层析法得到抗体纯度低，特异性差。因此，本发明人提出采用将生物样本经过深层过滤后，通过亲和层析法将复杂的血液成分进行分离，然后再通过超滤法进行浓缩，利用亲和层析的抗原抗体反应，使得到的抗ifn-γ自身抗体能够保证抗体的天然构型。

4、在其中一个实施例中，所述深层过滤包括以下步骤：采用平衡缓冲液对琼脂糖凝胶浸润，离心，对所述生物样本进行过滤，离心，得到所述上清液。

5、在其中一个实施例中，所述亲和层析包括第一亲和层析和第二亲和层析，所述第一亲和层析的填料包括干扰素γ，所述第二亲和层析的填料包括蛋白a琼脂糖凝胶，或蛋白g琼脂糖凝胶。

6、本发明人在针对抗ifn-γ自身抗体进行研究的过程中，之所以现有技术中缺乏对抗ifn-γ自身抗体的特异性结合位点，是因为业界对于抗ifn-γ自身抗体的性质没有明确，不清楚是否为igg类抗体或者其他任意一种蛋白，而本发明人在研究过程中，通过逐步摸索和反复实验，发现抗ifn-γ自身抗体是以多克隆igg抗体的形式存在，因此，本发明人提出采用多次亲和层析的方法进行纯化，通过上述多次亲和层析的方法能够将复杂的血液成分进一步分离，实现血液到粗组分抗体混合物，再到特异性igg的高特异性纯化过程，并且由于利用了亲和层析的抗原抗体反应，更好的保证抗体的天然构型，纯化得到的抗ifn-γ自身抗体可以直接投入科研使用。

7、在其中一个实施例中，所述第一亲和层析包括以下步骤：将干扰素γ加入抗体亲和层析柱，得到第一亲和层析柱，采用平衡缓冲液对第一亲和层析柱进行平衡，采用平衡缓冲液稀释所述上清液，得到稀释上清液，将所述稀释上清液进行上样，使所述稀释上清液与所述第一亲和层析柱进行蛋白耦合，采用洗脱缓冲液进行洗脱，得到层析液。

8、在其中一个实施例中，所述第一亲和层析步骤中，所述蛋白耦合的流速为1±0.2ml/min，所述洗脱的目的蛋白保留时间为5-10min，所述洗脱的流速为1.5±0.2ml/min。

9、在其中一个实施例中，所述第二亲和层析包括以下步骤：将蛋白a琼脂糖凝胶或蛋白g琼脂糖凝胶加入抗体亲和层析柱，得到第二亲和层析柱，采用平衡缓冲液对第二亲和层析柱进行平衡，将所述层析液进行上样，使所述层析液与所述第二亲和层析柱进行蛋白耦合，离心，除去离心液，加入平衡缓冲液，采用洗脱缓冲液进行洗脱，离心，得到初提物。

10、在其中一个实施例中，所述浓缩包括以下步骤：将平衡缓冲液加入所述初提物，以超滤法进行浓缩，得到抗ifn-γ自身抗体；所述超滤法的膜包包括聚醚砜和再生纤维素纤维中的至少1种。

11、在其中一个实施例中，所述膜包的分子量为10kd。

12、在其中一个实施例中，所述生物样本为血液，血清，或血浆；

13、所述平衡缓冲液包括磷酸缓冲液，tris缓冲液，和tris-hcl缓冲液中的至少1种，所述洗脱缓冲液包括tris-hcl缓冲液，和柠檬酸钠缓冲液中的至少1种。

14、在其中一个实施例中，所述tris-hcl缓冲液的ph＝2.0-3.0，所述柠檬酸钠缓冲液的ph＝3.0-4.0。

15、在其中一个实施例中，所述深层过滤步骤中的平衡缓冲液为ph＝7.4，渗透压为280-315mosm/kg，钙、镁元素的含量为0的磷酸缓冲液；

16、所述第一亲和层析步骤中的平衡缓冲液为ph＝7.4，渗透压为280-315mosm/kg，钙、镁元素的含量为0的磷酸缓冲液；

17、所述第二亲和层析步骤中，用于平衡的平衡缓冲液为ph＝7.4，渗透压为280-315mosm/kg，钙、镁元素的含量为0的磷酸缓冲液；除去离心液后加入的平衡缓冲液为ph＝9.0的tris-hcl缓冲液；所述第二亲和层析步骤中的洗脱缓冲液为ph＝2.8，含有甘油和edta的tris-hcl缓冲液；

18、所述浓缩步骤中的平衡缓冲液为ph＝7.4，渗透压为280-315mosm/kg，钙、镁元素的含量为0的磷酸缓冲液。

19、本发明还提供了一种产品，该产品包括抗ifn-γ自身抗体，所述抗ifn-γ自身抗体由所述纯化工艺制备得到；所述产品为诊断试剂，生物材料，或生物大分子。

20、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

21、本发明的一种抗ifn-γ自身抗体的纯化工艺及其应用，该纯化工艺将生物样本经过深层过滤后，通过亲和层析法将复杂的血液成分进行分离，然后再通过超滤法进行浓缩，利用亲和层析的抗原抗体反应，使得到的抗ifn-γ自身抗体能够保证抗体的天然构型。并且整个纯化工艺无需硫酸铵为代表的盐析技术参与，纯化得到的抗ifn-γ自身抗体产率高、纯度高。