嵌合转换受体及其应用的制作方法

本发明涉及生物制药领域，具体地，本发明涉及一种嵌合转换受体及其应用，具体地涉及一种csr-免疫细胞及其在肿瘤治疗领域的应用，更具体地，本发明涉及一种可同时识别两种抗原配体的嵌合转换受体及对应核酸分子、表达载体、慢病毒载体、转基因免疫细胞、药物组合物及其用途。

背景技术：

1、嵌合转换受体(csr，chimeric switch receptor)是一种人工构建的重组受体，包含胞外的抗原识别结构域、跨膜区及胞内区的信号转导结构域。与嵌合抗原受体的胞外抗原识别结构域由单链抗体构成不同，嵌合转换受体的胞外抗原识别结构域主要由免疫细胞的抑制性表面受体构成。嵌合转换受体通过识别抑制性受体的配体，从而将原有的免疫抑制性信号转变为免疫活化性信号，激活免疫细胞，触发针对表达抑制性受体配体的靶细胞的免疫应答。基于嵌合转换受体的免疫细胞疗法是肿瘤治疗领域的新兴方向。

2、嵌合转换受体的免疫细胞疗法在肿瘤治疗中有较好的应用前景，但疗效仍有待进一步提高。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种可同时识别两种免疫受体的配体抗原的嵌合转换受体，本发明的嵌合转换受体可同时识别两种免疫受体的配体抗原，表达该嵌合转换受体的免疫细胞在识别两种免疫受体的配体抗原中任意一个后，即能被激活，从而实现免疫细胞对肿瘤抗原识别的“或门”逻辑门控效应，解决了肿瘤免疫逃逸和肿瘤抗原异质性的问题，更有效地逆转来自肿瘤微环境抑制性信号的抑制，避免免疫细胞比如nk细胞发生免疫耗竭，有效提高了基于嵌合转换受体的免疫细胞的治疗效果。

2、需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：

3、肿瘤具有异质性，虽然抑制性受体tigit的配体及抑制性受体pd-1的配体在肿瘤细胞高表达，但即便是在同一种肿瘤细胞中，也经常不同时表达，比如只有一部分肿瘤细胞表达其中一种配体、另一部分肿瘤细胞表达另一种配体的情况时有发生；同时，肿瘤逃逸机制也会导致肿瘤细胞tigit或pd-1的配体丢失的情况发生。因此，传统的单一嵌合抗原受体或嵌合转换受体不能对其进行有效识别、疗效有限。

4、为了解决上述问题，发明人大胆地提出了如下设想：在一种免疫细胞(如nk细胞或t细胞)中同时表达两种嵌合转换受体，由此得到的免疫细胞预期对上述两种情况下的肿瘤细胞均能有效识别，进而触发抗肿瘤效应、提高疗效。进一步地，发明人选择了人类抑制性受体tigit和人类抑制性受体pd-1的胞外结构域作为嵌合转换受体的胞外抗原识别结构域。经过大量生物信息学模拟及筛选试验，得到了两条与pd-l1和cd155结合活性良好的tigit、pd-1胞外截短体。

5、为进一步提高免疫细胞治疗效果，发明人巧妙地将tigit和pd-1的胞外截短体连接起来，并作为胞外抗原识别结构域，得到了同时含有两种抗原识别结构域的嵌合转换受体。

6、进一步的试验结果表明，经含有上述tigit和pd-1抗原识别结构域的嵌合转换受体基因修饰的nk细胞，能同时识别tigit配体和pd-1配体，可以将来自tigit或pd-1识别相应配体所传递的任一抑制性信号逆转为活化信号，避免肿瘤微环境中的nk细胞丧失功能或发生耗竭。进一步的动物水平试验结果表明，上述基因修饰的nk细胞可有效识别部分表达tigit配体或部分表达pd-1配体的肿瘤细胞，也可有效识别丢失pd-1或tigit其中一种受体配体的肿瘤细胞。由此，解决了肿瘤免疫逃逸和肿瘤抗原异质性的问题，提高了基于嵌合转换受体的免疫细胞的治疗效果。

7、因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种嵌合转换受体。所述嵌合转换受体包括：胞外区，所述胞外区包括第一结合片段和第二结合片段，所述第一结合片段具有如seq id no：10所示的氨基酸序列，所述第二结合片段具有如seq id no：11所示的氨基酸序列；跨膜区，所述跨膜区的n端与所述胞外区的c端相连；胞内区，所述胞内区的n端与所述跨膜区的c端相连。本发明的嵌合转换受体同时具有pd-l1和cd155结合活性，表达本发明的嵌合转换受体的免疫细胞，可有效识别部分表达tigit配体或部分表达pd-1配体的肿瘤细胞，也可有效识别丢失pd-1或tigit其中一种受体配体的肿瘤细胞。

8、在本发明的第二方面，本发明提出了一种核酸分子，所述核酸分子编码上述的嵌合转换受体。携带有上述核酸分子可在免疫细胞中表达本发明第一方面的嵌合转换受体，该嵌合转换受体可以在识别tigit配体、pd-1配体中的任意一个后，能激活所述免疫细胞，实现免疫细胞对肿瘤抗原识别的“或门”逻辑门控效应。

9、在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体，所述表达载体携带本发明第二方面的核酸分子。由此，利用构建得到的表达载体表达在细胞内可有效表达得到本发明第一方面的嵌合转换受体。

10、在本发明的第四方面，本发明提出了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体携带具有如seq id no：1或seq id no：15所示的核苷酸序列。将本发明第四方面的慢病毒载体导入受体细胞后，该受体细胞可实现本发明第一方面的嵌合转换受体的表达。

11、在本发明的第五方面，本发明提出了一种转基因免疫细胞，所述转基因免疫细胞表达本发明第一方面的嵌合转换受体，或携带本发明第二方面的核酸分子、本发明第三方面的表达载体或本发明第四方面的慢病毒载体。由此，获得的转基因免疫细胞可进一步用于肿瘤治疗，并且具有显著提高的肿瘤杀伤活性和有效降低的免疫细胞耗竭状态。临床上，只需要施用本发明的免疫细胞，即可有效消除因免疫逃逸和/或肿瘤抗原异质性而产生的肿瘤患者对治疗性免疫细胞的耐药性。同时，相对于依次或同时施用多种治疗性免疫细胞来识别不同肿瘤细胞配体的治疗方案，本发明的免疫细胞临床应用更安全、便捷，有利于细胞疗法的临床应用。

12、在本发明的第六方面，本发明提出了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第一方面的嵌合转换受体、本发明第二方面的核酸分子、本发明第三方面的表达载体、本发明第四方面的慢病毒载体或本发明第五方面的转基因免疫细胞。由此，获得的药物组合物可进一步用于肿瘤疾病的预防或治疗。

13、在本发明的第七方面，本发明提出了本发明第一方面的嵌合转换受体、本发明第二方面的核酸分子、本发明第三方面的表达载体、本发明第四方面的慢病毒载体、本发明第五方面的转基因免疫细胞或本发明第六方面的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗肿瘤。利用本发明的嵌合转换受体及对应的核酸分子、表达载体、慢病毒载体、转基因免疫细胞或药物组合物可进一步制备成药物，该药物在临床上可用于预防或治疗疾病。

14、本领域技术人员能够理解的是，前面针对嵌合转换受体、核酸分子、表达载体、慢病毒载体、转基因免疫细胞和药物组合物所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。

15、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。