一种人体脐带间充质干细胞无血清培养基及分离培养方法与流程

本发明涉及干细胞及再生医学，具体涉及一种人体脐带间充质干细胞无血清培养基及分离培养方法。

背景技术：

1、干细胞(stemcells,sc)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌健、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，医学界称为“万用细胞”。具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下不仅可分化为造血细胞，还具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。

2、目前干细胞的体外培养方法主要是用dmem/f12培养基为基础，添加fbs，并添加一些细胞所需的其他营养物质。但是fbs中含有动物源成分，会有一些未知的风险，且具有伦理争议，因此，在此基础上，发明出一种各成份明确且无外源成份的干细胞无血清培养基。

技术实现思路

1、针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种人体脐带间充质干细胞无血清培养基及分离培养方法，采用人体脐带干细胞，可获得各成份明确且无外源成份的干细胞，获得的干细胞在无血清培养基中培养，可实现提高干细胞的扩增效率及后续应用。

2、为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：一种人体脐带间充质干细胞无血清培养基，无血清培养基添加物为：使用干细胞培养用的基础培养基dmem/f12，在此基础上，添加层粘连蛋白，egf，bfgf，大豆胰酶抑制剂，胰岛素，牛血清白蛋白，非必须氨基酸。

3、进一步的，添加物的各组分用量以终浓度计：层粘连蛋白0.01-0.03ul/ml，egf0.03-0.05ul/ml，bfgf 0.09-0.11ul/ml，大豆胰酶抑制剂13-15ug/ml，胰岛素14-16ug/ml，牛血清白蛋白0.28-0.32g/ml，非必需氨基酸9-11ul/ml。

4、进一步的，添加物的各组分用量以终浓度计：层粘连蛋白0.02ul/ml，egf 0.04ul/ml，bfgf 0.10ul/ml，大豆胰酶抑制剂14ug/ml，胰岛素15ug/ml，牛血清白蛋白0.3g/ml，非必需氨基酸10ul/ml。

5、一种人体脐带间充质干细胞分离培养方法，具体步骤为：

6、步骤1，制备无血清培养基；

7、步骤2，用添加1％双抗的生理盐水清洗脐带组织直至将血块清洗干净，将清洗后的脐带组织剪成2-3cm的小段，将脐带组织中的血管挑出；

8、步骤,3，将步骤2中处理后的脐带组织剪成约2-3mm3的组织块状，然后加入0.1％的i型胶原酶完全浸没组织块，消化30min，消化完成后，用步骤1中的完全培养基终止消化；

9、步骤4，将步骤3中的混合液经100um滤网过滤后，滤液1200r，离心10min，弃上清，培养基重悬沉淀，接种培养。

10、综上，本发明提供一种人体脐带间充质干细胞无血清培养基及分离培养方法，采用人体脐带干细胞，可获得各成份明确且无外源成份的干细胞，获得的干细胞在无血清培养基中培养，可实现提高干细胞的扩增效率及后续应用。

技术特征：

1.一种人体脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，无血清培养基添加物为：使用干细胞培养用的基础培养基dmem/f12，在此基础上，添加层粘连蛋白，egf，bfgf，大豆胰酶抑制剂，胰岛素，牛血清白蛋白，非必须氨基酸。

2.根据权利要求1所述的一种人体脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，添加物的各组分用量以终浓度计：层粘连蛋白0.01-0.03ul/ml，egf 0.03-0.05ul/ml，bfgf0.09-0.11ul/ml，大豆胰酶抑制剂13-15ug/ml，胰岛素14-16ug/ml，牛血清白蛋白0.28-0.32g/ml，非必需氨基酸9-11ul/ml。

3.根据权利要求2所述的一种人体脐带间充质干细胞无血清培养基及分离培养方法，其特征在于，添加物的各组分用量以终浓度计：层粘连蛋白0.02ul/ml，egf 0.04ul/ml，bfgf 0.10ul/ml，大豆胰酶抑制剂14ug/ml，胰岛素15ug/ml，牛血清白蛋白0.3g/ml，非必需氨基酸10ul/ml。

4.一种人体脐带间充质干细胞分离培养方法，其特征在于，具体步骤为：

技术总结
本发明公开了一种人体脐带间充质干细胞无血清培养基及分离培养方法，无血清培养基添加物为：使用干细胞培养用的基础培养基DMEM/F12，在此基础上，添加层粘连蛋白，EGF，bFGF，大豆胰酶抑制剂，胰岛素，牛血清白蛋白，非必须氨基酸；将步骤2中处理后的脐带组织剪成约2‑3mm<supgt;3</supgt;的组织块状，然后加入0.1％的I型胶原酶完全浸没组织块，消化30min，消化完成后，用步骤1中的完全培养基终止消化，采用人体脐带干细胞，可获得各成份明确且无外源成份的干细胞，获得的干细胞在无血清培养基中培养，可实现提高干细胞的扩增效率及后续应用。

技术研发人员：丁伟,张溪研,李昂,董新波
受保护的技术使用者：徐州区域细胞制备中心有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14