培养GBF1敲除ST细胞的培养基、方法及其用途与流程

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及培养gbf1敲除st细胞的培养基、方法及其用途。

背景技术：

1、猪瘟病毒(classical swine fever virus,csfv)是猪流行性腹泻(classicalswine fever,csf)的病原体，猪瘟病毒感染后会抑制病猪的免疫功能，常引发与其他疾病的混合感染及母猪的隐形感染，作为危害我国生猪养殖业的一类主要的传染病，每年造成巨大的经济损失。

2、目前针对此病尚无有效的治疗方法，预防猪瘟主要以接种有效的疫苗为主，现如今市场上使用最多、效果最好是弱毒活细胞苗，其是以猪瘟病毒在st细胞中增殖后经收集、浓缩、过滤等工艺制备的。

3、因此，开发出一种新型的治疗猪瘟的方法刻不容缓。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。

2、crispr/cas9技术是近些年迅速发展起来的能够用于哺乳动物细胞的新型基因编辑技术，在很多领域均具有非常好的应用前景。利用该技术对st细胞中调控细胞转运蛋白进行缺失，提高猪瘟病毒在st细胞中的增殖与释放，将有助于提高猪瘟疫苗的产量或质量。

3、外被体蛋白ⅰ(copⅰ)是一种由7个不同亚基组成的胞质溶胶蛋白质复合物，copⅰ囊泡可以携带各类分子从高尔基体到内质网的逆向转运，介导高尔基体内物质的逆向和正向运输过程,并维持高尔基体结构与膜囊的成熟。有研究表明，细胞内的囊泡运送系统与病毒的侵染、定位、组装增殖与释放密切相关，而高尔基体特异性bfa抗性因子1(gbf1)相关蛋白是cop i重要的下游调控因子，其可影响病毒在细胞中的增殖、组装与释放。发明发现，通过crispr基因编辑技术对st细胞中gbf1基因进行缺失，可实现猪瘟病毒在st细胞中的高效组装与复制，以提高猪瘟疫苗的产量与质量。

4、因此，发明人研发了一种gbf1基因敲除的st细胞系的构建方法，利用crispr/cas9技术对猪瘟弱毒疫苗生产用st细胞系中的gbf1基因进行敲除，将用于gbf1基因的sgrna和ssdna共转染至st细胞后，利用嘌呤霉素筛选结合梯度稀释，用克隆环法结合亚克隆技术分离到多个细胞克隆。提取基因组dna后进行pcr扩增、测序，结合western-blot验证，并成功鉴定到了1个gbf1基因敲除的st细胞克隆。将gbf1敲除的st细胞系中扩大培养，接种猪瘟病毒后，通过检测猪瘟病毒的增殖情况，发现猪瘟病毒复制速率明显加快，最终病毒滴度有明显提高，说明有用于猪瘟疫苗生产的前景。

5、为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种st细胞系。根据本发明的实施例，所述st细胞系中的gbf1基因被沉默。

6、需要说明的是，本技术所述的“被沉默”是指基因的活性被抑制或基因的表达量下调，既可包括基因的活性被部分抑制或基因的表达量被部分下调，也可包括基因的活性被全部抑制或基因的表达量被全部下调。

7、根据本发明的实施例，所述gbf1基因被沉默是通过crispr/cas9技术实现的。

8、在本发明的又一个方面，本发明提出了前面所述的st细胞系在制备猪瘟疫苗中的用途。发明人发现采用crispr基因编辑技术对st细胞中gbf1基因进行缺失，可实现猪瘟病毒在st细胞中的高效组装与复制，从而提高猪瘟疫苗的产量与质量。

9、在本发明的另一个方面，本发明提出了一种培养用于制备疫苗的st细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述的细胞系在经过优化的st-slm培养基中进行培养，以便获得用于制备疫苗的st细胞，其中，所述经过优化的st-slm培养基是在基础dmem培养基中额外添加下列成分：l-丙氨酸、l-盐酸精氨酸、l-天门冬氨酸、l-门冬酰胺、l-半胱氨酸盐酸盐一水、l-胱氨酸二盐酸盐、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、甘氨酸、l-盐酸组氨酸一水、l-羟脯氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-盐酸赖氨酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、丙氨酰谷氨酰胺、丙酮酸钠、hepes、无水磷酸氢二钠、d-无水葡萄糖、还原型谷胱甘肽、七水硫酸亚铁、七水硫酸锌、维生素c、氯化胆碱、肌醇、九水硝酸铁、氯化锂、重组人胰岛素、柠檬酸铁、维生素b12、五水硫酸铜、六水氯化镁、d-生物素、次黄嘌呤、亚油酸、硫辛酸、1，4-丁二胺二盐酸盐、维生素b2、胸苷、对氨基苯甲酸、氯化铝、乙酸钡、六水氯化钴、四水氯化锰、氟化钠、氯化亚锡、氯化镉、二氧化锗、亚硒酸钠、九水偏硅酸钠、氯化镍、偏钒酸铵、胆固醇、维生素e、维生素a醋酸酯、烟酸、2d-脱氧核糖、氢化可的松、egf、igf、钼酸铵、乙醇胺、胰岛素、维生素e醋酸酯、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、吐温80。st细胞在经过优化的st-slm培养基能够大量增殖，在降低血清使用量的同时解决细胞结团率高、生长速度慢的问题。

10、根据本发明的实施例，额外添加成分在所述经过优化的st-slm培养基中的终浓度为：

11、

12、

13、

14、根据本发明的实施例，所述基础dmem培养基包括：

15、

16、

17、根据本发明的实施例，st细胞系中的gbf1基因被沉默是通过crispr/cas9技术实现的；其中，sg rna包括seq id no:1或2所示的核苷酸序列：

18、caccgccatcaaacgaaatgcccga(seq id no:1)；

19、aaactcgggcatttcgtttgatggc(seq id no:2)。

20、在本发明的又一个方面，本发明提出了一种制备病毒疫苗的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：根据前面所述的方法培养所述st细胞；和在所述培养过程中接种病毒，以利用所述st细胞对所述病毒进行扩增；和收集所述扩增的病毒并进行对所述病毒进行减毒或者灭活处理，以便获得所述病毒疫苗。

21、根据本发明的实施例，所述病毒包括选自猪瘟病毒、狂犬病毒、流感病毒、冠状病毒、法氏囊病毒、登革热病毒、肠道病毒、脑炎病毒、痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、反向病毒、披膜病毒、黄病毒、肠道病毒、细小核糖核酸病毒、嵌沙样病毒、疱疹病毒、腺病毒、牛痘病毒以及sars病毒的至少之一。

22、根据本发明的具体实施例，所述病毒选自猪瘟病毒。

23、在本发明的又一个方面，本发明提出了一种用于培养st细胞的经过优化的st-slm培养基。根据本发明的实施例，所述st细胞携带经过基因改造的gbf1基因，所述经过优化的st-slm培养基是在dmem培养基中额外添加下列成分：l-丙氨酸、l-盐酸精氨酸、l-天门冬氨酸、l-门冬酰胺、l-半胱氨酸盐酸盐一水、l-胱氨酸二盐酸盐、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、甘氨酸、l-盐酸组氨酸一水、l-羟脯氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-盐酸赖氨酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、丙氨酰谷氨酰胺、丙酮酸钠、hepes、无水磷酸氢二钠、d-无水葡萄糖、还原型谷胱甘肽、七水硫酸亚铁、七水硫酸锌、维生素c、氯化胆碱、肌醇、九水硝酸铁、氯化锂、重组人胰岛素、柠檬酸铁、维生素b12、五水硫酸铜、六水氯化镁、d-生物素、次黄嘌呤、亚油酸、硫辛酸、1，4-丁二胺二盐酸盐、维生素b2、胸苷、对氨基苯甲酸、氯化铝、乙酸钡、六水氯化钴、四水氯化锰、氟化钠、氯化亚锡、氯化镉、二氧化锗、亚硒酸钠、九水偏硅酸钠、氯化镍、偏钒酸铵、胆固醇、维生素e、维生素a醋酸酯、烟酸、2d-脱氧核糖、氢化可的松、egf、igf、钼酸铵、乙醇胺、胰岛素、维生素e醋酸酯、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、吐温80。st细胞在经过优化的st-slm培养基能够大量增殖，在降低血清使用量的同时解决细胞结团率高、生长速度慢的问题。

24、根据本发明的实施例，额外添加成分在所述经过改造的st-slm培养基中的终浓度为：

25、

26、

27、根据本发明的实施例，所述基础dmem培养基包括：

28、

29、

30、在本发明又一个方面，本发明提出了一种疫苗。根据本发明的实施例，所述疫苗是根据前面所述的方法制备的。通过该方法制备的疫苗能够加快猪瘟病毒增殖速率，提高猪瘟疫苗的产量与质量。

31、在本发明又一个方面，本发明提出了前面所述的疫苗在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防病毒相关疾病。

32、根据本发明的实施例，所述病毒包括选自猪瘟病毒、狂犬病毒、流感病毒、冠状病毒、法氏囊病毒、登革热病毒、肠道病毒、脑炎病毒、痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、反向病毒、披膜病毒、黄病毒、肠道病毒、细小核糖核酸病毒、嵌沙样病毒、疱疹病毒、腺病毒、牛痘病毒以及sars病毒的至少之一。

33、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。