H9N2亚型AIV多拷贝M2e蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用与流程

本发明属于h9n2亚型aiv，尤其涉及一种h9n2亚型aiv多拷贝m2e蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用。

背景技术：

1、流感病毒(influenza virus,iv)属于正黏病毒科(orthomyxoviridae)，该科含有四个属，分别是甲型流感病毒(influenza a virus,iav)、乙型流感病毒(influenza bvirus,ibv)、丙型流感病毒(influenza c virus,icv)和丁型流感病毒(influenza dvirus,idv)。其中iav的易感宿主最多，包括人、禽、猪、马、水貂和蝙蝠等动物。禽流感病毒(avian influenza virus,aiv)属于甲型流感病，根据禽流感病毒粒子上的血凝素(hemagglutinin,ha)蛋白和神经氨酸酶(neuraminidase,na)蛋白的抗原差异，可将aiv分为16种ha亚型和9种na亚型。根据对家禽致病的强弱，将aiv分为高致病性aiv(highpathogenic avian influenza virus,hpaiv)和低致病性aiv(low pathogenic avianinfluenza virus,lpaiv)。hpaiv仅限于h5和h7亚型的部分亚型(主要以h5n1和h7n7亚型aiv为代表)，低致病性aiv涵盖剩余亚型的aiv。h7n9、h7n4、h7n7、h5n1、h5n8、h5n6、h6n1、h9n2和h10n3亚型aiv均被报道能够感染人，因此aiv被认为对人类健康具有潜在的威胁。

2、aiv是单股负链rna病毒，基因组由8个不连续的基因片段构成，分别是血凝素(ha)、核蛋白(np)、神经氨酸酶(na)、聚合酶b2(pb2)、聚合酶b1(pb1)、聚合酶a(pa)、基质蛋白(m)和非结构蛋白(ns)；m2蛋白的外结构域(m2e)在甲型流感病毒中非常保守，被认为是开发广谱甲型流感疫苗的候选靶基因。研究表明多拷贝m2e偶联其他蛋白(如np蛋白、na蛋白和ha蛋白等)或与运载工具(乙型肝炎核心颗粒、人乳头瘤病毒l蛋白、细胞外膜复合物和鞭毛蛋白等)联合表达的蛋白免疫试验动物能够提高m2e蛋白的免疫原性，免疫所产生的抗体能够保护免疫动物免受不同亚型甲型流感病毒得攻击。研究显示，人、禽和猪流感病毒的m2e蛋白上的第10-20氨基酸有差异，分别是：pirnewgcrcn(人)、ptrngweckcs(禽)和pirngwecrcn(猪)，并且特异性识别人流感病毒m2e蛋白的单克隆抗体只能微弱的识别来源于禽流感毒株的m2e蛋白。h9n2亚型aiv是目前家禽中分布最广泛的低致病性aiv，研究也显示我国h9n2亚型aiv在活禽市场中分离率较高。因此，开展研究h9n2亚型aiv相关研究对其检测、预防及治疗十分必要。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种h9n2亚型aiv多拷贝m2e蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用，以期为h9n2亚型aiv医疗应用提供物质材料和技术支持。

2、为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

3、h9n2亚型aiv多拷贝m2e蛋白单克隆抗体，重链和轻链可变区分别具有序列表seq.id.no.1和seq.id.no.2的氨基酸序列。

4、重链亚型属于igg1，轻链亚型为kappa。

5、上述单克隆抗体在特异性识别h9n2亚型aiv多拷贝m2e蛋白中的应用。

6、多拷贝m2e蛋白为原核表达的2m2e、3m2e、4m2e蛋白，或者sf9细胞表达的3m2e蛋白。

7、上述单克隆抗体在生物诊断鉴定中的应用。

8、生物诊断为间接免疫荧光检测、western-blot鉴定。

9、分泌上述单克隆抗体的细胞系。

10、上述细胞系，为保藏编号cctcc no:c202328的杂交瘤细胞株4e10-a10(hybidomacell line 4e10-a10)。

11、上述杂交瘤细胞株的制备方法，使用h9n2亚型aiv 3m2e重组蛋白作为抗原免疫小白鼠，收集免疫后的小白鼠的脾细胞，并将脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合得到融合细胞；用含hat的培养基培养融合细胞，间接elisa法筛选生长状态稳定、分泌单克隆抗体效价高且稳定的细胞株。

12、针对目前h9n2亚型aiv相关研究存在的问题，发明人在前期研究的基础上研制了一种h9n2亚型aiv多拷贝m2e蛋白单克隆抗体，重链和轻链可变区分别具有序列表seq.id.no.1和seq.id.no.2的氨基酸序列。据此，还建立了相关细胞系及其制备方法。本发明杂交瘤细胞株4e10-a10的保藏编号cctcc no:c202328，试验表明，其分泌的抗多拷贝m2e蛋白单克隆抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别2m2e、3m2e和4m2e重组蛋白及表达h9n2亚型禽流感病毒3m2e蛋白的细胞，适用于间接免疫荧光检测和western-blot鉴定。综上，本发明为aiv m2e单克隆抗体对aiv的作用机制研究和开展以aiv m2e蛋白为靶点的广谱疫苗应用效果评价提供了物质材料和技术支持。

技术特征：

1.一种h9n2亚型aiv多拷贝m2e蛋白单克隆抗体，其特征在于重链和轻链可变区分别具有序列表seq.id.no.1和seq.id.no.2的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：所述重链亚型属于igg1，轻链亚型为kappa。

3.权利要求1所述单克隆抗体在特异性识别h9n2亚型aiv多拷贝m2e蛋白中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述多拷贝m2e蛋白为原核表达的2m2e、3m2e、4m2e蛋白，或者sf9细胞表达的3m2e蛋白。

5.权利要求1所述单克隆抗体在生物诊断鉴定中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述生物诊断为间接免疫荧光检测、western-blot鉴定。

7.分泌权利要求1所述单克隆抗体的细胞系。

8.根据权利要求7所述的细胞系，其特征在于为保藏编号cctcc no:c202328的杂交瘤细胞株4e10-a10(hybidoma cell line 4e10-a10)。

9.一种权利要求8所述杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：使用h9n2亚型aiv 3m2e重组蛋白作为抗原免疫小白鼠，收集免疫后的小白鼠的脾细胞，并将所述脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合得到融合细胞；用含hat的培养基培养融合细胞，间接elisa法筛选生长状态稳定、分泌单克隆抗体效价高且稳定的细胞株。

技术总结
本发明公开了一种H9N2亚型AIV多拷贝M2e蛋白单克隆抗体，重链和轻链可变区分别具有序列表SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2的氨基酸序列。据此，还建立了相关细胞系及其制备方法。本发明杂交瘤细胞株4E10‑A10的保藏编号CCTCC NO:C202328，试验表明，其分泌的抗多拷贝M2e蛋白单克隆抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别2M2e、3M2e和4M2e重组蛋白及表达H9N2亚型禽流感病毒3M2e蛋白的细胞，适用于间接免疫荧光检测和Western‑blot鉴定。综上，本发明为AIV M2e单克隆抗体对AIV的作用机制研究和开展以AIV M2e蛋白为靶点的广谱疫苗应用效果评价提供了物质材料和技术支持。

技术研发人员：谢芝勋,张民秀,李孟,罗思思,谢丽基,李丹,阮志华,范晴,曾婷婷,张艳芳,黄娇玲,王盛,李小凤
受保护的技术使用者：广西壮族自治区兽医研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13