一种单管检测多靶标的荧光PCR方法及其应用与流程

本发明涉及生物检测，特别涉及一种单管检测多靶标的荧光pcr方法及其应用。

背景技术：

1、荧光pcr法指在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定性或定量分析的方法。根据其使用的荧光物质，可以分为染料法和荧光探针法。荧光pcr法检测多个靶标或多个病原体，目前常用的方法有以下几种：

2、(1)多色荧光溶解曲线：如公告号为cn103290115b的中国发明专利公开了一种利用mlpa对肺炎链球菌进行血清型分型的方法，以mlpa通用扩增引物pcr扩增已杂交并连接好的mlpa探针，使用多色荧光溶解曲线分析pcr产物，实现对肺炎链球菌进行血清型分型。在pcr反应结束后，对pcr产物进行溶解曲线分析，根据溶解曲线特征波峰位置所对应的tm值，区分检测的靶标，以此实现单通道所靶标的检测。该方法结合荧光pcr仪的多色通道，可实现多色多靶标的检测。

3、但多色荧光溶解曲线的方法是在pcr结束后，进行溶解曲线分析，主要依靠pcr产物tm值、溶解曲线的特征峰来区分不同的靶标，对仪器温控要求相对较高，且耗时长。

4、(2)微流控：通过微流控的技术，在耗材和设备上增加反应孔数实现检测多靶标，该方法耗时短。

5、但微流控技术，耗材成本较高，且需要使用专用设备，成本相对较高。此外，使用微流控技术，试剂保存及耗材存放都需要更多的保护措施，有些甚至还需使用冻干微球技术，增加了试剂成本。

6、(3)探针或分子信标荧光pcr法：针对所要检测的靶标，设计一套特异性检测的引物探针，根据所用仪器的通道数量，在探针上标记不同的荧光基团，每个荧光通道对应一个检测靶标，根据仪器所具备的荧光通道数量，可以检测相应数量的靶标，该方法耗时较短，成本较微流控技术低。

7、但探针或分子信标荧光pcr法检测多靶标时，通常需要使用到多个荧光通道，当检测的靶标数量超过仪器设备的荧光通道数量时，则需要多管联合检测，使得仪器检测通量下降。从结果判读角度来看，多管多通道的荧光pcr方法进行多靶标联合检测容易出现混淆或误判的情况。从试剂成本角度来看，使用多管多通道的荧光pcr方法多靶标联合检测，由于使用多管，例如酶、dntps等存在多管的成本，综合成本依然较高。

8、因此，如何在单管下检测多个靶标成为了荧光pcr法进一步改进的关键。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种单管检测多靶标的荧光pcr方法及其应用。

2、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种单管检测多靶标的荧光pcr方法，扩增反应结束后，根据软件采集并分析得到的扩增曲线平台期荧光值的高度，判读区分各检测靶基因。

3、本发明采用的另一技术方案为：上述单管检测多靶标的荧光pcr方法在定性分析和定量分析上的应用。

4、本发明的有益效果在于：本发明的荧光pcr方法，在各方面均具有优势：

5、(1)判读结果上，可避免多管的孔间联合判读导致的误判；

6、(2)耗时上，不使用溶解曲线或其他产物分析方法，耗时与荧光pcr相同；

7、(3)成本上，本发明的荧光pcr方法使用的为单管，大大节省了多管，例如酶、dntps等扩增试剂原料的使用量，成本较低。

8、本发明的单管检测多靶标的荧光pcr方法可用于定性，也可用于定量分析，定量分析时需增加一组标准物质，根据ct值及标准物质的浓度绘制标准曲线，既可实现对所检测病原体的定量。

技术特征：

1.一种单管检测多靶标的荧光pcr方法，其特征在于，扩增反应结束后，根据软件采集并分析得到的扩增曲线平台期荧光值的高度，判读区分各检测靶基因。

2.根据权利要求1所述的单管检测多靶标的荧光pcr方法，其特征在于，为单通道检测，具体包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的单管检测多靶标的荧光pcr方法，其特征在于，所述探针的5’端均标记相同的荧光标记，3’端标记相同的淬灭基团。

4.根据权利要求2所述的单管检测多靶标的荧光pcr方法，其特征在于，所述pcr反应体系包括pcrbuffer、引物探针混合液、depc水、核酸模板和酶混合液。

5.根据权利要求2所述的单管检测多靶标的荧光pcr方法，其特征在于，所述pcrbuffer、引物探针混合液、depc水、核酸模板和酶混合液的体积比为25：10：20～23：20：3～5。

6.根据权利要求2所述的单管检测多靶标的荧光pcr方法，其特征在于，所述探针的加入量的确认方法为：先进行探针加入量的梯度实验，得到所有探针加入量与平台荧光值的线型范围，根据线型范围计算每条特异性序列得到不同的平台荧光值时，各探针所需的加入量。

7.根据权利要求1所述的单管检测多靶标的荧光pcr方法，其特征在于，为多通道检测，具体包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的单管检测多靶标的荧光pcr方法，其特征在于，所述每组探针的加入量的确认方法为：先进行探针加入量的梯度实验，得到该组中探针加入量与平台荧光值的线型范围，根据线型范围计算每条特异性序列得到不同的平台荧光值时，每组中各探针所需的加入量。

9.根据权利要求7所述的单管检测多靶标的荧光pcr方法，其特征在于，每组中的所述探针根据荧光通道，在5’端均标记相同的荧光标记，3’端标记相同的淬灭基团。

10.权利要求1～9任意一项单管检测多靶标的荧光pcr方法在定性分析和定量分析上的应用。

技术总结
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种单管检测多靶标的荧光PCR方法及其应用。该荧光PCR方法，扩增反应结束后，根据软件采集并分析得到的扩增曲线平台期荧光值的高度，判读区分各检测靶基因。该荧光PCR方法通过扩增曲线的平台荧光值差异，区分不同病原体，可实现单管单个荧光通道的多靶标检测，当靶标数量超过仪器设备的荧光通道数量时，还可采用单管多个荧光通道的多靶标检测，检测更多靶标，成本低、耗时短，具有普适性。

技术研发人员：黄海峰,李晓燕,洪炯志,蔡晓沂
受保护的技术使用者：泰普生物科学（中国）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14