一种烟草全基因组SNP位点组合、探针、芯片及其应用的制作方法

本发明属于烟草遗传育种，具体涉及一种烟草全基因组snp位点组合探针、芯片及其应用。

背景技术：

1、普通烟草是重要的经济作物之一，为了培育出优质、适产、抗逆性强的烟草品种，多年来研究者们多年来坚持不懈的进行着烟草的良种培育工作，并推广出云烟87、k326和红花大金元等栽培品种。

2、而在烟草的育种工作中，主要经历了如下几个阶段：1)农家育种阶段：该阶段主要依赖于农民经验，有意识、偶然发现并选择品种变异的育种阶段；2)杂交育种阶段：通过配置杂交组合创造变异，利用田间试验设计和生物统计知识提高选择效率的育种阶段；3)分子育种阶段：包括分子标记辅助选择、转基因和基因编辑育种等，主要是一个综合利用遗传、基因组信息，借助分子生物学等手段加速变异产生且选择效率大幅提升的育种阶段。其中，分子辅助育种技术的关键环节即是开发遗传变异相关的dna分子标记，并利用检测手段研究利用遗传变异，提高育种的选择效率；而snp(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)技术作为第三代分子标记，因其在全基因组范围内数量多，分布均匀，易于基因分型，适合规模化高通量检测等特点，已成为当前遗传研究中主流分子标记被开发利用。

3、snp技术是借助高通量测序平台和snp芯片是检测基因组范围内snp变异并利用的有效途径。经过多年的技术发展，当前snp芯片技术所采用的测序平台主要分为affymetrixsnp基因分型平台(affymetrix 技术)、illumina snp基因分型平台(包括技术和技术)、液相snp基因分型平台(genotyping by targetedsequencing,gbts、靶向测序技术)，三类平台的技术原理存在较大差异，其中靶向测序技术主要是基于目标探针与靶向序列互补结合进行定点捕获，借助二代高通量测序平台获取序列信息，并利用基因组重测序数据分析挖掘出变异信息，该技术对数据分析水平需求较高；illumina和affymetrix snp基因分型平台二者均可划为固相芯片，主要是利用光蚀刻技术，通过不同方式将探针序列固定在玻璃载体上，如illumina采用微珠技术，将dna探针序列偶联到微珠的表面，再将各种微珠均匀地撒在已经通过光蚀刻技术蚀刻出很多微孔的玻璃基片上，而affymetrix的技术则是直接在玻璃载体表面通过光蚀刻的方法植上探针序列。从产品类别和应用市场规模看，affymetrix snp基因分型平台有较大优势，在水稻、小麦、玉米、大豆、棉花等主要作物中均有相对成熟的商业化产品，包括目录芯片和定制芯片，如中国农业科学研究院基于该平台，设计开发了660k、55k和55k等不同规格的小麦snp芯片等。

4、然而在烟草snp芯片的研究和利用上，当前国内及国际上尚无成熟的目录芯片可用，国内科研单位虽然基于est(表达序列标签)、gbs(基因组简约法)、rad(限制性内切酶位点标签)、rnaseq(转录组测序)等手段开发了一些snp标记，但是这些标记在基因组覆盖度方面存在明显的不足，因此，急需开发一种适用于规模化烟草种质资源鉴定、功能基因挖掘和育种材料背景分析等方面的烟草全基因组snp芯片，以弥补当前烟草snp芯片的不足。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供了一种烟草全基因组snp位点组合探针、芯片及其应用，其能够进行烟草种质资源或育种群体材料规模化、高通量、低成本的基因分型检测工作，满足烟草种质资源鉴定及进一步育种利用的需求，加快了烟草种质资源利用和分子育种的选择效率。

2、为实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下：

3、一种烟草全基因组snp位点组合在基因分型、全基因组关联分析、全基因组连锁分析、分子标记辅助选择育种、分子指纹图谱构建、遗传资源基因型鉴定任一项中的应用，所述烟草全基因组snp位点组合包括18981个snp位点，所述18981个snp位点的物理位置是基于烟草品种k326基因组序列比对确定的，所述烟草品种k326基因组序列的获取网址为：https://solgenomics.net/ftp/genomes/nicotiana_tabacum/edwards_et_al_2017/；依据其在参考基因组物理位置及基因型进行编号，且按照参考基因组chromosome(染色体/连锁群)和scaffold(框架序列)，以及位置顺序从小至大依次排列，编号范围为nt01:122369:t/g～nitab4.5_0941907:351:a/g(具体见表1，其中“:”为分割符，将每个snp位点编号分为三部分，第一部分表示位点所在参考基因组中chromosome或scaffold名称，第二部分表示位点所在参考基因组中chromosome或scaffold中位置，第三部分表示位点变异的基因型，a、t、g、c为脱氧核糖核苷酸的缩写，分别表示腺嘌呤脱氧核苷酸(damp)、胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dtmp)、鸟嘌呤脱氧核苷酸(dgmp)和胞嘧啶脱氧核苷酸(dcmp)

4、因此，所述18981个snp位点的物理位置信息见表1，在表1中，所述snp位点的物理位置采用chromosome或scaffold名称：位点所在参考基因组中chromosome或scaffold中位置：位点变异的基因型的形式表示，其中ni为nitab4.5的简写。

5、表1烟草18981个snp位点的信息

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136、作为进一步的技术方案，所述烟草为普通烟草；所述普通烟草指的是不包含烟属中烟草野生种的烟草。所述烟草野生种包括林烟草(nicotiana sylvestris)、绒毛状烟草(nicotiana tomentosiformis)等。

137、一种检测所述烟草全基因组snp位点组合的探针组合在基因分型、全基因组关联分析、全基因组连锁分析、分子标记辅助选择育种、分子指纹图谱构建、遗传资源基因型鉴定任一项中的应用。

138、一种检测所述烟草全基因组snp位点组合的芯片在基因分型、全基因组关联分析、全基因组连锁分析、分子标记辅助选择育种、分子指纹图谱构建、遗传资源基因型鉴定任一项中的应用，所述芯片包含所述的探针组合。

139、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

140、本发明在snp位点的筛选过程中，采用原始snp位点来自于150个涵盖烤烟、晒烟、晾烟、白肋烟、雪茄烟、香料烟、药烟等多种类型烟草代表性品种材料；各位点多态性指数较高(平均pic为0.34，最小为0.2)；在烟草全基因组范围内，特别是非重复序列区，每200kb区间含有1～5个snp位点，均匀度好，且重点选择位于外显子区snp位点，并参考了该snp位点和临近位点连锁不平衡信息；确定的snp位点基因组信息选择国际上公开的k326参考基因组，并兼顾了国内烟草参考基因组信息，各位点所在序列片段在参考基因组上均为唯一匹配，便于后期各位点位置信息随参考基因组优化升级而更新，此外，相较于现有技术而言，本发明不仅位点得到极大的丰富，而且检测成本实现了大幅降低，满足了烟草分子育种对育种材料规模化、大批量基因分型的需要。

141、本发明通过利用公开的烟草k326参考基因组，筛选获得的一批覆盖烟草全基因组，且分布均匀、多态性好、位置明确、经过试验验证确定质量可靠的snp位点集合，可以满足烟草分子遗传研究中烟草种质资源基因型鉴定、分子指纹图谱构建、育种材料基因分型、全基因组关联分析/连锁分析、分子标记辅助选择育种等相关的研究需求。

142、本发明开发的检测烟草全基因组snp位点组合的芯片(ta-ld-sc)可进行商业化，对烟草全基因组选择育种、分子设计育种及育种芯片的开发等具有重要经济价值和良好应用前景。